肺成纖維細胞在肺纖維化進程中的作用

高 建，劉 干，李 俊

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種嚴重的肺間質疾病，其發生的主要病理特點是早期的彌漫性肺泡炎，后期大量成纖維細胞病理性增殖轉型及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)進行性異常積聚并取代正常的肺組織結構［1］，實質是肺泡損傷，肺組織過度修復，異常重塑的過程。其發病原因很多，如病原微生物、粉塵、藥物、化學制劑等多種因素均可誘導產生肺纖維化［2-3］。統計資料顯示其5年生存率低于50%，10年生存率約30%，目前尚缺乏有效防治手段，因此尋找防治肺纖維化有效藥物，一直是國內外藥物研究的熱點［4］。肺纖維化肺纖維化過程中，成纖維細胞(fibroblast，FB)扮演著極為重要的角色，本文就FB在肺纖維化過程中所發揮的作用及機制作一綜述，從而進一步探討更為明確的發病機制，尋求更多的藥物作用靶點，為肺纖維化的治療治療提供新思路。

1 成纖維細胞的形態結構與功能

生理條件下，成纖維細胞是肺臟結締組織中主要的細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞(mesenchymal cell)分化而來，其形態多樣，大多呈梭形、多角形和扁平星形等，具有突起。成纖維細胞胞體較大，胞質弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質疏松色淺，核仁明顯。其形態可依細胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發生改變。電鏡下，其胞質可見豐富的粗面內質網、游離核糖體和發達的高爾基復合體，提示它具有合成和分泌蛋白質和膠原纖維、彈性纖維、網狀纖維及有機基質的功能。但成纖維細胞的早期，胞體變小，呈長梭形，粗面內質網和高爾基復合體退化，這一階段通常稱之為纖維細胞(fibrocyte)。在特殊情況下，纖維細胞可以重新轉變為成纖維細胞狀態而發揮相關作用［5］。生理條件下，FB的主要功能包括:構造和維持肺臟的正常形態，合成和釋放ECM，為肺組織和細胞的高效交換氣體提供物質基礎，構成肺組織的主要支架，維持肺上皮和內皮細胞正常生理作用，以及組織損傷后及時大量聚集修復損傷組織。病理條件下，FB主要是通過自身的異常增殖與轉型以及大量分泌ECM兩個方面參與肺纖維化進程。

2 肺成纖維細胞異常增殖轉型直接觸發PF

肺纖維化過程中，多種因素的共同影響，尤其是大量細胞因子的刺激作用，會使FB不斷地增殖和轉型為肌成纖維細胞(myofibroblast，MB)。其中最為關鍵的因素是轉化生長因子 β(transforming growth factors-β，TGF-β)。它是目前認為的致纖維化作用最強的細胞因子之一，它們通過與相應的受體結合，刺激成纖維細胞增殖并誘導其向MB轉化［6-7］。MB是一種特殊階段的FB，能夠大量分泌ECM，分泌能力是FB的4～5倍。其與FB的主要區別在于是否明顯表達α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)［8］。提示α-SMA可作為肌成纖維細胞的標示物之一。但有的學者［9］提出，活化轉型的MB中并不是全部高表達α-SMA這提示單一依靠檢測α-SMA來衡量FB的轉型程度可能會出現假陽性的結果。隨著FB數目的不斷增加，肺部的成纖維灶逐漸形成，并且逐漸取代正常的肺細胞組織，引起肺部結構的異常重塑，進而觸發PF。這一過程是FB參與PF的重要方面之一。需要注意的是，盡管FB的增殖轉型是成纖維細胞灶的主要來源，但近年的研究表明［10］，在肺纖維化過程中部分成纖維細胞灶的細胞可能由其他肺部細胞轉化而來，并有作者提出“上皮-間質轉分化”(epithelial-mesenchy-mal transition，EMT)這一概念，認為肺泡上皮細胞向間質細胞轉化是纖維化過程中局部成纖維細胞的重要來源之一。Iwano等［11］通過研究腎間質纖維化機制發現腎間質纖維化狀態下的腎成纖維細胞約42%來源于腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell，RTEC)的轉化。此外，體外研究表明Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ，COLⅠ)可促使RTEC形態改變，主要表現為細胞變大，兩端出現類似腎成纖維細胞極性，產生突起，細胞間的緊密連接消失。免疫組化則顯示腎成纖維細胞特異蛋白-1(+)、RTEC角蛋白(-)［12］。提示Ⅰ型膠原可以促進RTEC通過EMT方式轉化為腎成纖維細胞。另外其他體外實驗證明TGF-β1刺激的大鼠原代肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell，AEC)的間質細胞標記物(α-SMA、COL-Ⅰ)表達上調，同時上皮細胞標記物(水通道25、細胞角蛋白)表達下調，同時其形態也向纖維細胞樣轉變［12-14］。提示部分AEC在肺纖維化過程中向FB轉化是成纖維細胞灶細胞的來源之一。EMT發生過程中，β-連環蛋白信號在肺纖維組織修復過程中有著誘導上皮細胞向間質細胞轉換的作用［15］。EMT的轉分化方式可能與多條信號轉導通路有關，Ras、Rho、Src、Smads等信號轉導通路均參與EMT過程的調控，每個信號通路活化各自的核內轉錄因子，最終調節靶向基因的表達，介導 EMT的發生［16-17］。近來研究表明［18］，通過給于肺纖維化大鼠吸入NO，可以明顯減少肺成纖維細胞的數量，減輕肺纖維化癥狀。表明NO對于上皮細胞的功能的調節機制可能是對抗肺纖維化的一個潛在的靶點。

FB觸發PF的過程中，眾多細胞因子對FB的增殖轉型起著重要的調控作用。生理條件下，正性調節因子與負性調節因子趨于平衡，保證了FB的正常增殖與凋亡。但在PF中，由于正性調節因子的大量釋放，而負性調節因子的分泌遭到抑制，導致細胞因子網絡平衡失調，FB大量異常增殖轉型進而觸發PF。這也提示我們是否可以增加負性調節因子活力，誘導成細胞胞凋亡來對抗FB的進展?Hadden等［19］研究FB的凋亡信號轉導途徑發現RGD、CS-1和FN-C/H-V 3種可溶性纖維多肽能夠誘導肺成纖維細胞凋亡，其機制可能是阻礙了由整合素介導的細胞生存信號通路及相關的生物學效應，如抑制了細胞黏附、基質金屬蛋白酶、某些致炎因子和抗炎因子的表達，從而調節程序性細胞死亡。

3 肺成纖維化細胞大量分泌細胞外基質直接觸發PF

ECM是指分布于細胞膜的細胞外空間，由細胞分泌的蛋白和多糖所構成的網狀結構，主要由膠原蛋白、纖維連接蛋白、透明質酸、蛋白聚糖等成分構成。在正常肺組織中，膠原蛋白是肺組織的主要ECM，約占肺臟干重的1/5，而在這些膠原蛋白中，以Ⅰ型和Ⅲ膠原蛋白為主。基質金屬蛋白酶(MMPs)是分解細胞外基質的主要酶類，基質金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPS)則特異性的抑制MMPs對ECM的分解作用。MMPs/TIMPS系統是控制ECM代謝平衡的關鍵系統。生理情況下，肺內膠原的合成與降解處于平衡狀態［20］。但在肺纖維化過程中，MMPs/TIMPS系統平衡被破壞，產生以FB大量分泌ECM，ECM過度聚集為特征的紊亂現象。這種紊亂的重要原因之一在于多種細胞因子刺激FB的轉型為MB，進而大量分泌膠原蛋白，導致大量的ECM異常聚集。國內外研究表明眾多細胞因子在促進FB大量合成釋放ECM的過程中起著重要的調節作用。有學者甚至認為［21］肺纖維化是由多種細胞因子啟動并維持的膠原蛋白失調的結果。TGF-β促進ECM聚集主要是通過Smads介導的信號轉導通路來實現的。研究發現Smad3敲除小鼠表現出的纖維化損傷比野生型小，Ⅰ型膠原mRNA及纖維連接蛋白mRNA和蛋白的表達量也比野生型的少。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)則是 TGF-β 發揮作用的下游效應介質，報道表明，在人胚肺成纖維細胞中，CTGF可通過PI3K/PKB信號轉導和轉錄激活子3信號通路，促進肺成纖維細胞轉型，另外還可能通過抑制p27Kip1的表達，上調cyclinD1而誘導細胞轉型而大量分泌ECM［22］。因此有人考慮通過阻斷CTGF的信號轉導通路來達到拮抗PF進展的目的，其中脂氧素A4(lipoxinA4，LXA4)可阻斷以上信號通路，實驗表明表達轉染LXA4受體樣蛋白基因可以加強LXA4對CTGF誘導成纖維細胞增殖轉型的抑制效應［23］。Hashimot等［24］證實IL-4和IL-13可通過JNK途徑促使FB向MB轉化。另外血小板源性生長因子(PDGF)可通過與PDGF受體結合，對成纖維細胞產生強烈趨化作用和致有絲分裂作用，有效刺激成纖維細胞轉型增殖，并能誘導血管生成，進而刺激ECM的合成［25］。巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migrationinhibitory factor，MIF)則通過促進 TGF-β1的表達，從而間接促進FB大量分泌ECM。目前認為MIF主要通過激活Rho激酶途徑來實現這種促進作用［26］。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF)可以與胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)結合，不僅能夠直接促進細胞增殖轉型，釋放大量ECM，還可以加強TGF-β、PDGF等其它致纖維化因子的致纖維化作用來參與PF［27］。總之，在多種細胞因子的共同刺激下，FB轉型分化為MB，大量分泌ECM，同時由于MMPs/TIMPS系統平衡被破壞，導致ECM異常聚集，這是FB其參與PF進程的另一重要方面之一。

4 肺成纖維細胞作用于其他細胞間接觸發PF

肺纖維過程中，除了FB通過自身的增殖轉型形成成纖維細胞灶和大量分泌ECM來參與肺纖維化進展外，FB還可以作用于一些其他的細胞或者刺激自身而間接參與PF。

4.1 肺成纖維細胞作用肺泡上皮細胞觸發PF 肺泡上皮細胞(AEC)分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型AEC的功能主要是維持肺泡結構，在其受到損傷凋亡后，AECⅠ可以迅速增殖、分化來進行補充與修復。Ⅱ型AEC是肺泡上皮的干細胞，具有無限增殖的潛能［28］，其中參與肺纖維化的主要是AECⅡ。FB作用于AECⅡ間接參與PF主要是通過兩個途徑來實現:①受多種因素影響，分泌維持AECⅡ正常生長與修復的物質的功能被破壞，導致AECⅡ受損。② 分泌TGF-β誘導部分AECⅡ向成纖維細胞轉化來參與PF。

一直以來，大家主要關注于肺纖維化的始發階段——肺泡上皮損傷，研究這一階段所導致的后續效應:FB的異常增殖轉型以及一系列炎癥反應。但很少研究FB的異常增殖轉型是否可以反向促進AECⅡ的損傷而產生惡性循環加快PF的進展?目前認為生理條件下FB通過分泌肺泡表面活性物質來維持AECⅡ的正常生長與修復和抑制其轉型［29］。實驗表明加入FB上清液的AECⅡ組7 d和28 d時Ⅱ型肺泡表面活性物質相關蛋白A(SP-A)mRNA和肝細胞因子(HGF)mRNA均比照組低，且7 d和28 d時SP-A和HGF的表達無明顯差異，提示在肺纖維化過程中，FB正常分泌SPA和HGF來維持AECⅡ正常修復生理功能可能已經被破壞，而隨著時間的變化，指標并沒有明顯的差異則可能意味AECⅡ的自我修復功能已經喪失［30］。這些都顯示在肺纖維化過程中，FB可以抑制AECⅡ的修復功能，促進AECⅡ的損傷，加快PF進展。其他研究也得出了類似的結論:從IPF患者分離出的成纖維細胞和肌成纖維細胞可以促進AEC損傷凋亡［31］，損傷后的AECⅡ主要通過表達一系列參與成纖維細胞移行、增殖、轉分化和ECM重構的分子，如MMPs，趨化因子和多種致纖維化因子等來促進PF。其中MMP-2和MMP-9可降解肺泡壁ECM和基底膜中幾乎所有的蛋白成分，導致AECⅡ損傷后的修復時間延長，使成纖維細胞、炎癥細胞趁機侵入肺間質并增殖，觸發PF。

目前認為TGF-β主要來自于肺泡巨噬細胞的分泌，但在PF過程中，FB也可分泌 TGF-β來參與肺纖維化。Xu等［32］也發現，接受TGF-β1處理后的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞株上調α-SMA和波紋蛋白的表達，而下調上皮細胞標記物上皮鈣粘附素和細胞角蛋白-19的表達，且細胞伸長變形為纖維樣細胞。這提示我們在肺纖維化中，FB可能還可通過自分泌TGF-β誘導部分AEC轉化為FB，使之成為成纖維細胞灶的來源之一，參與PF。

4.2 肺成纖維細胞作用于炎癥細胞參與PF PF過程中，活化的FB可以通過分泌多種炎性因子來刺激炎癥細胞，主要有 IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、內皮素-1(ET-1)等。IL-1和IL-6主要通過趨化炎癥細胞聚集，促進炎癥細胞侵潤，加快肺纖維化早期階段——肺泡炎癥的進展，進而介導PF的發生。其中IL-1還可以上調黏附分子分泌，促使白細胞進入肺間質促進炎癥反應。TNF-α則上調黏附分子和化學趨化分子，與IL-1一起激活中性粒細胞，介導肺泡炎癥反應。ET-1是一個很重要的前炎癥因子，它可刺激肺部花生四烯酸1，5-脂氧化酶活力和氧自由基(ROS)生成，刺激中性粒細胞釋放彈性蛋白酶，激活肥大細胞，并且誘導單核細胞產生ROS、前列腺素E、白三烯、蛋白酶等釋放而加重肺泡炎癥。ET-1還可改變多形核中性粒細胞(PMN)的變形能力，促進它們在肺內的潴留。在ET-1誘導作用下，PMN細胞內游離的G-肌動蛋白迅速排列纖維成為細絲狀的F-肌動蛋白，降低了細胞變形能力。這一變形能力可被NO的供體硝普鈉(SNP)抑制［33］。在卵白蛋白致敏的小鼠實驗中，ET-1受體拮抗劑BQ-123和SB209670使支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞數目分別降低了47%和68%，它們均能抑制中性粒細胞在肺中的浸潤［34］。表明ET-1能促進炎癥細胞在肺部的浸潤。總之，FB還可以通過分泌某些炎性因子來刺激炎癥細胞，加重肺泡炎性損傷參與PF。

4.3 肺成纖維細胞刺激自身參與PF 在肺纖維的發生過程中，FB可以自己分泌一些與纖維化相關的細胞因子直接加速PF的進程。比如，分泌的TGF-β、PDGF等可以直接促進自身的增殖轉型，促使FB大量分泌ECM。尤其是轉型后的肌成纖維細胞還可高表達MMP-9來降解基膜的蛋白，為FB的移行創造條件。

5 結語

肺成纖維細胞作為肺纖維化過程中至關重要的細胞之一，其異常轉型增殖形成肺成纖維細胞灶和大量分泌ECM，介導ECM的大量沉積是PF過程中關鍵事件，是PF進展的重要原因。此外FB還可以通過作用于肺泡上皮細胞和一些炎性細胞或間接參與PF。鑒于FB在PF的重要作用，因此有關肺成纖維細胞在PF中發揮作用的更多機制需要我們來探討。近年來，由于多種細胞因子因具有強烈致纖維化作用，已被廣泛用于體外肺纖維化模型的研究。但目前大都局限于研究單一細胞因子的刺激作用。PF中是否存在多種細胞因子相互促進而放大這種致纖維化作用?能否利用這種放大作用來建立一種更為優越的體外肺纖維化模型?這將是我們下一步工作的目標。

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