牛膝應(yīng)用于大鼠同種異體肢體移植抗排斥反應(yīng)的研究

馮磊 張震宇 谷文光

(1.齊齊哈爾市第一醫(yī)院 黑龍江齊齊哈爾 161000; 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 黑龍江哈爾濱 150000)

牛膝具有明顯的免疫抑制作用,已被廣泛認可,但其發(fā)揮免疫抑制功能的作用機制,并為完全明了,有大量實驗研究表明,牛膝抗排斥反應(yīng)的作用途徑是多方面、多角度的。在免疫細胞水平的抑制作用,可明顯抑制T、B淋巴細胞的轉(zhuǎn)運功能,對巨噬細胞和NK細胞都有一定抑制作用。在免疫分子水平的抑制作用,通過抑制IL～2、IL～6的分泌,從而對細胞毒T細胞的產(chǎn)生和成熟形成有一定的抑制作用,影響其對靶細胞的殺傷能力。其他途徑,可以抑制細胞毒T淋巴細胞的功能,減弱其釋放穿孔素和顆粒酶B的表達能力,從而影響CTL細胞對靶細胞的殺傷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

受供者分別為10～12周齡清潔及純系健康雄性Wistar大鼠、SD大鼠,體重200～250g,購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物中心和北京維通利華公司,實驗動物均在清潔級條件下喂養(yǎng)。

1.2 實驗方法

牛膝水提取物的制備由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑局協(xié)助完成。將牛膝粉碎后加雙蒸水浸泡,煮沸3次,合并3次藥液放入4℃冰箱中過夜,以3000r/min 離心30min取上清液用雙蒸水稀釋。

1.3 實驗分組

雄性Wistar大鼠及雄性SD大鼠各27只。隨機分成3組,每組各9只。SD大鼠為受體,Wistar大鼠為供體。實驗分為3組,每組9只。移植肢體術(shù)后2d內(nèi)死亡的認為發(fā)生手術(shù)并發(fā)癥,不進入實驗觀察,另行手術(shù)補充。A組(牛膝組):將牛膝水化稀釋為0.25g/mL,術(shù)后術(shù)后當(dāng)日起每隔1d天灌服1次,劑量為5mg/kg。B組(對照組):術(shù)后不用免疫抑制劑,僅應(yīng)用生理鹽水10mL/kg·d-1灌服。C組(環(huán)孢素A,CsA)組:術(shù)后將CsA用生理鹽水稀釋為1mg/mL,術(shù)后當(dāng)日起每隔1d灌服1次,劑量為5mg/kg。

1.4 檢測指標

1.4.1 一般指標 觀察項目包括大鼠的活躍程度、飲食、大小便、生命體征、皮膚、體毛、傷口有無分泌物、紅腫;移植物的血循、顏色、溫度、腫脹程度、體毛的變化、皮膚水皰、滲出、潰瘍、糜爛、焦痂、足趾變黑壞死等,詳細記錄各種變化的時間及情況。

1.4.2 急性排斥反應(yīng)的觀測 根據(jù)異體移植肢體的血運變化和皮膚表現(xiàn),觀察各組移植肢體急性排斥反應(yīng)的發(fā)生時間和移植肢體存活時間,其中急性排斥反應(yīng)的發(fā)生時間嚴格限定在移植肢體皮膚出現(xiàn)紅斑水腫持續(xù)24h,移植肢體壞死標準為皮膚脫落或出現(xiàn)干性壞疽。

1.4.3 移植肢體組織的光鏡標本制備及觀察 于術(shù)后1、3、5、7d切取異體移植肢體包括皮膚、脛前肌、骨、坐骨神經(jīng)、脛前血管的組織塊,消毒縫合切口。用10%甲醛固定,常規(guī)方法制備樣本。

2 病理學(xué)診斷和分級

并根據(jù)Lee和Buttermeyer推薦的移植物排斥反應(yīng)標準進行分級0級為無排斥,各組織正常,無炎性細胞浸潤;I級為輕度排斥,血管周圍及骨骼肌間質(zhì)內(nèi)局灶性炎性細胞浸潤,皮膚基底層細胞空泡化;II級為中度排斥,血管周圍及骨骼肌間質(zhì)內(nèi)多灶性炎性細胞浸潤,皮膚上基底層細胞大泡形成;III級為重度排斥,彌漫性多類型炎性細胞浸潤,伴有各組織明顯的出血、水腫、脈管炎、壞死或纖維化。因為皮膚的排斥反應(yīng)最強,所以本實驗統(tǒng)計每組皮膚排斥反應(yīng)的病理學(xué)分級平均值。CD4+、CD8+細胞檢測術(shù)后對各組模型行鼠尾取血,用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群中CD4+、CD8+細胞的百分率及CD4+/CD8+的比值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,進一步多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

大鼠一般于手術(shù)后逐漸清醒,起初精神狀況較差,但可以飲水、行走、恢復(fù)大小便,術(shù)后當(dāng)日基本上可以進食。1d后宿主的精神狀況、飲食、大小便、生命體征基本恢復(fù)正常。

通過術(shù)后連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),A、B組大鼠術(shù)后1～2d移植肢體皮溫較健側(cè)肢體稍高,移植物腫脹較輕,血運良好。術(shù)后3～4d開始,移植物開始腫脹,先是移植物的上端和足背部,然后迅速加重和擴展,5～6d左右皮膚變濕,7～8d左右肢體毛發(fā)開始脫落,皮膚出現(xiàn)紅斑并伴糜爛以大腿的內(nèi)上側(cè)出現(xiàn)最早,9～13d整個移植物變黑壞死。C組大鼠術(shù)后移植肢體也輕度腫脹,于術(shù)后8～9d天腫脹開始明顯,最終于14～19d移植物變黑壞死。A組排斥反應(yīng)時間(9.62±2.37),肢體平均存活時間（16.11±1.72）;B組排斥反應(yīng)時間(7.13±1.37),肢體平均存活時間(11.14±1.31);C組排斥反應(yīng)時間(13.71±2.48),肢體平均存活時間(21.32±1.53)。

5 討論

同種異體移植排斥反應(yīng)的本質(zhì)就是免疫應(yīng)答過程,都要經(jīng)過抗原識別、免疫細胞活化分化和效應(yīng)階段[1]。有結(jié)果顯示,同種異體移植排斥反應(yīng)和常規(guī)免疫應(yīng)答的不同之處主要在于抗原識別和效應(yīng)階段。同種異體組織器官移植后,發(fā)生急性排斥反應(yīng)時CD4+T細胞升高,CD8+細胞下降及CD4+/CD8+的比值升高。本實驗應(yīng)用牛膝后,CD4+、CD4+/CD8+的比值明顯降低,CD8+明顯增高,有延長移植物存活時間和動物模型存活時間的作用,有力的證實了牛膝具有明顯抑制排斥反應(yīng)的作用。綜上所述,大量實驗已證明牛膝在抗排斥反應(yīng)有明顯的作用,但其具體明確的抑制途徑和副作用,還需要進一步的實驗研究證實,盡管需要解決的問題不少,但我們相信,隨著各種相關(guān)研究的深入,中藥免疫抑制劑的基礎(chǔ)研究,以及未來的臨床應(yīng)用將會有廣闊的前景,因此,隨著實驗技術(shù)的提高,中藥免疫抑制劑作用機制會得到充分的揭示。相信不久的將來中藥免疫抑制劑在臨床的應(yīng)用將造福于人類。

[1]陳宗鍇,李電東.牛膝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J].藥學(xué)學(xué)報,1997,32(12):881～887.