人 C-反應蛋白的分離純化及初步應用

黃國團 王麗蘭 蔡豪斌, 秦新民 陽艷華 貝鴻池 張 旋

1.桂林英美特生物技術研究所,廣西 桂林 540001;2.桂林醫學院,廣西 桂林 541004;3.廣西師范大學,廣西 桂林 541004

C-反應蛋白 (CRP)是一種非常重要的急性時相反應蛋白,主要由肝臟合成。正常人群的 CRP 濃度很低,新生兒為 0.1～0.6mg/L,成年人為 0.4～5.2mg/L。炎癥、感染和組織損傷等發生后,CRP 濃度會迅速升高,病情轉好又迅速降低至正常水平,升高的幅度與病情的嚴重程度呈正相關[1]。檢測CRP 對于許多疾病的篩查、監測與療效評估具有重要價值。臨床應用中多采用免疫透射比濁法測定CRP,能夠實現自動化分析,使用方便快捷。

CRP 受到越來越多的關注,獲得CRP 對于進行生產研究具有重要意義。商品 CRP 具有較好的性能,但是價格昂貴。擬建立一種簡單經濟實用的分離純化人CRP 的方法,獲得高純度的 CRP,并進行初步應用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CNBr-activated Sepharose 4B(GE Healthcare),CRP(Leebio),PEG6000(SHBC),CRPMcAb(桂林英美特生物技術研究所),全自動生化分析儀 (日立 7080)。

1.2 方法

1.2.1 CRP 的分離純化

1.2.1.1 硫酸銨沉淀總蛋白

從醫院收集臨床血清樣本 (CRP＞100mg/L),用 80%飽和度的硫酸銨沉淀總蛋白,4℃沉淀過夜;于 4℃、8000rpm 離心 30min,用基礎緩沖液 (20mmol/L Tris-HCl,pH 7.8)溶解沉淀,充分透析除去硫酸銨。

1.2.1.2 初步純化CRP

取適量活化好的 DEAE 填料按常規方法裝柱,用基礎緩沖液平衡。經過預處理的樣品上樣,通過改變離子強度進行梯度洗脫 (洗脫液中 NaCl 濃度分別為 80、120、250mmol/L),按 A280收集洗脫液,進行 SDS-PAGE 電泳和 Western Blotting 檢測 。

1.2.1.3 親和層析精制純化CRP

取 1gCNBr-activated Sepharose 4B 填料用 1mmol/L HCl進行溶脹及洗滌,加入 30mg 用偶聯緩沖液 (100mmol/L NaHCO3,500mmol/L NaCl,pH 8.3)充分透析的 CRP McAb,4℃搖擺偶聯過夜;用 1mol/L 的乙醇胺封閉 2h;以緩沖液A(100mmol/L NaAc,500mmol/L NaCl,pH 4.0)與緩沖液 B(100mmol/L Tris-HCl,500mmol/L NaCl,pH 8.0)交替洗滌 3次,裝柱。初步純化的目的蛋白用結合緩沖液 (20mmol/L Tris-HCl,120mmol/L NaCl,pH 7.8)充分透析后,上樣,以洗脫液 (100mmol/L NaAc,500mmol/L NaCl,pH 2.9)洗脫,按 A 280收集洗脫液,進行檢測[2]。

1.2.2 CRP 多克隆抗體的制備純化

選一只成年健康山羊作為免疫動物,以自提高純度CRP 為抗原,按常規方法制備多克隆抗體,采用正辛酸-硫酸銨法進行純化,并進行檢測。

1.2.3 CRP 免疫透射比濁定量檢測方法的建立及評價

用制備的多克隆抗體建立CRP 免疫透射比濁定量檢測方法,并進行評價[3]。采用兩點終點法,主波長為 340nm,反應溫度為 37℃,S、R1、R 2的進樣體積分別為 10、 180、20μL,分析點為 16、31,免疫非線性多點定標 (測定均在日立 7080全自動生化分析儀上完成)。

2 結果

2.1 CRP的檢測結果

DEAE 離子交換層析初步分離純化除去了大部分雜蛋白,但目的蛋白純度不高;通過親和層析進一步精制純化取得了很好的效果。SDS-PAGE 結果顯示最終的純化產物中出現相對分子質量約為 23000的主帶 (圖 1),凝膠掃描顯示其相對純度為 93.1%;Western Blotting 結果顯示其能與 CRP 單克隆抗體發生特異性結合 (圖 2),證實為 CRP,且與商品 CRP 有很好的可比性。

2.2 CRP多克隆抗體的檢測結果

SDS-PAGE 結果表明純化后的CRP 多克隆抗體純度高(圖 3);Western Blotting 結果顯示其能與 CRP 發生特異性結合 (圖 4);其總蛋白含量為 36.3mg/mL,ELISA 效價為1：256000。

2.3 CRP免疫透射比濁定量檢測方法的建立及評價結果

2.3.1 試劑主要成份的確定

以 40mmol/L,pH 7.5的磷酸鹽 (含 100mmol/L NaCl)為基礎緩沖液,R 1中PEG 6000的最佳濃度為 40g/L;R2中CRP 多克隆抗體的最佳濃度為 10mg/mL。

2.3.2 線性范圍

將高濃度的 CRP 樣本稀釋形成不同濃度的樣本,均重復測定 3次。結果表明 CRP 濃度在 3.1～150.0mg/L 范圍內線性良好 (y=0.0013x+0.0038,R2=0.9948)。

2.3.3 檢出限

測定 CRP 濃度為 0.0mg/L 的樣本,連續重復測定 20次,得出檢出限為 0.4mg/L(DL=K'SD/k,K'=3)。2.3.4 重復性

取不同濃度的樣本,批內重復性試驗連續重復測定 20次;批間重復性試驗每天測定 1次,連續 20 d。批內、批間不精密度水平﹤ 5%,表明具有良好的重復性。

2.3.5 穩定性

將試劑 (R 1、R2)置于 37℃,分別于第 1d、3d、5d、7d 取出用于測定。5d 內不精密水平﹤ 10%,表明具有良好的穩定性。

2.3.6 比對試驗

分別用自制試劑與德國德賽試劑測定臨床樣本 (n=40)。其回歸方程為 y=1.0325x+0.6502,R 2=0.9997,經t 檢驗得P＞0.05,表明兩者具有很好的可比性。

3 討論

從人或動物的組織、體液或細胞中分離純化所獲得的蛋白,與生理狀態下的蛋白最為接近,研究應用價值比較大。血清中成份比較復雜,采用單一方法難以取得很好的效果,應根據 CRP 性質特點綜合運用不同方法進行分離純化。如果直接采用親和層析進行分離純化,洗脫難度大,分離純化效果有限,且會降低親和層析柱的使用壽命。實驗運用飽和硫酸銨對樣本進行預處理和 DEAE 離子交換層析進行初步分離純化,除去了大部分雜蛋白,在此基礎上運用制備 CRP 單克隆抗體親和層析柱進行精制純化。分離純化獲得高純度的 CRP,與商品CRP 有很好的可比性。成功建立了一種分離純化人CRP 的方法,能夠以較低成本大量獲得高性能的 CRP,有利于進行生產研究。

考慮到反應的敏感性,試劑成本,技術要求等因素,免疫透射比濁試劑中多使用多克隆抗體而不是單克隆抗體。運用自提高純度的 CRP 為抗原,可持續大量制備出高質量的CRP 多克隆抗體;并初步建立起CRP 免疫透射比濁法,各方面性能指標均比較好,為研制 CRP 免疫透射比濁試劑奠定了基礎。

[1]Rosalki SB.C-reactive protein[J].Int J Clin Pract,2001,55(4)：269-270.

[2]馬宏偉,趙衛國,潘柏申.親和層析法分離純化人心肌肌鈣蛋白 I[J].檢驗醫學,2007,22(3)：304-307.

[3]Bence LM,Addie DD,Eckersall PD.An immunoturbidimetric assay for rapid quantitative measurementof feline alpha-1-acid glycoprotein in serum and peritoneal fluid[J].Vet Clin Pathol,2005,34(4)：335-341.