βAmyloid蛋白在恒河猴腦組織中的形態學特點

趙 喬，蔡 青，孟 霞，朱立鳴，李勝利，焦守恕，王 鉅

（首都醫科大學實驗動物科學部，首都醫科大學電鏡室，北京 100069）

目前關于阿爾茨海默癥（Alzhe imer’s disease，AD）的發病機制并不十分確定，但普遍認為［1］，過量的β淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）的產生和聚集（是senile plaque的主要成分），并參與神經纖維纏結（NFT）的形成，是AD重要的病理學特征之一。Aβ是I型跨膜蛋白淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的酶解產物［2］。Aβ通常以β-淀粉樣蛋白42（amyloid-βprotein 42，Aβ42）和β-淀粉樣蛋白40（amyloid-βprotein 40，Aβ40）兩種形式存在。Aβ的沉積導致老年斑的形成，可能是所有因素導致AD的共同途徑。目前AD相關研究在小鼠和大鼠等模型中取得了一定的成功，但是Aβ抗體藥物AN1792在APP轉基因小鼠上治療效果顯著［3，4］，在應用到臨床時卻在一些受試者出現了在小鼠沒有發生的嚴重的副作用，后來的研究發現同樣的副作用在猴子身上也能發生［5，6］。這就提示，Aβvaccine類的藥物在進入臨床試驗之前必須在非人靈長類動物上進行藥效和毒性實驗。那么Aβ淀粉樣蛋白在什么年齡的猴子腦中出現較多？主要出現在腦的哪些部位？哪種類型的Aβ淀粉樣蛋白在猴腦內老年斑的形成中起主要作用？本文試圖通過對不同年齡猴子的研究，對這些問題進行一些初步的討論。

本研究選用年輕組（5～10歲）和老年組（19～24歲）恒河猴（rhesusmonkey）為研究對象，分別選取額葉、海馬、顳葉和頂葉進行Aβ40和Aβ42的免疫組化染色。選取23歲恒河猴一只灌注取腦后進行免疫電鏡的超微結構觀察，初步從組織學和亞細胞水平觀察Aβ40和Aβ42的特點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：恒河猴12只，分為年輕組：年齡5～10歲和老年組：19～24歲，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供［SCXK-（軍）2002-001］。在首都醫科大學實驗動物部SPF級動物實驗設施中完成［設施許可證號：XYSK（京）2009-0020］。經1個月常規飼養無異常表現，心、肝、腎等重要器官血液生化指標檢測正常。

1.1.2 主要試劑：抗βAmyloid 1-40（ab10147）和抗βAmyloid 1-42多克隆抗體（ab10148）均購自Abcam公司；抗兔SP試劑盒（1/4）（SPN-9001）和DAB顯色試劑盒（ZL I-9018）均購自北京中杉金橋試劑公司；抗兔IgG膠體金標記二抗（58-15-06）購自KPL公司。pH7.6，0.2mol/L PB液（Na2HPO4.12H2O：71.64g；NaH2PO4.2H2O：31.21g。定容至1000mL）；包埋劑（環氧樹脂618：60％；DDSA：36％；DBP：3％；DMP-30：1％）。上述試劑依次加入，邊加邊攪拌，全部加完后磁力攪拌器15min，靜置于35℃～40℃溫箱內排除氣泡。銀增強液：SE-EM ACT IVATOR 40滴和SE-EM IN IT IATOR 1滴混勻后取一滴，與SE-EM ENHANCER 20滴再混勻即可。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色：取腦固定，切片：年輕組和老年組恒河猴實施安樂死后迅速斷頭取腦，分別取出額葉、海馬、顳葉和頂葉，放入含30％蔗糖的4％多聚甲醛固定，直至沉底。分別進行連續冠狀冰凍切片，切片厚40μm，入0.01mol/L PBST（0.01mol/L PBS，1％Triton）4℃保存，待染。

免疫組化染色（漂染）：70％甲酸抗原修復30min，ddH2O充分浸洗；3％雙氧水消除內源性過氧化物酶活性10min（避光），PBST充分浸洗；5％脫脂奶粉封閉抑制非特異性染色30min，PBST浸洗。切片在1％BSA-PBS一抗孵育液中4℃過夜，抗體稀釋濃度：抗βAmyloid 1-40多克隆抗體與抗βAmyloid 1-42多克隆抗體均為1∶200。浸洗后嚴格遵循抗兔SP試劑盒（1/4）說明進行二抗，三抗的孵育。不加一抗作為陰性對照。DAB顯色，裱片，干燥，封片。光鏡下，棕染有細胞形態的為陽性細胞。

1.2.2 免疫電鏡灌注取材：取8號23歲恒河猴，稱重7.5Kg，6％戊巴比妥鈉（30mg/kg）靜脈麻醉。開胸經左心室插管，0.01mol/L PBS（約需4000mL）灌流沖洗，然后用4％多聚甲醛（含3％戊二醛）灌流固定（約需4000mL），灌流完成后4℃靜置1h后取腦。取出額葉、海馬、顳葉和頂葉后置于4％多聚甲醛后固定8h，然后置于30％蔗糖（0.1mol/L PB）中待組織沉底。

1.2.3 免疫電鏡：組織塊經0.1mol/L PB充分浸洗，入0.5％NaBH4（0.1mol/L PB）20min（現用現配），0.01mol/LPBS充分浸洗，3％PBST（0.01mol/L PBS，3％Triton）浸洗20min，0.01mol/LPBS充分浸洗；6％羊血清（0.01mol/LPBS）封閉2h，無需浸洗直接入1％BSA-PBS一抗孵育液常溫2夜。抗體稀釋濃度：抗βAmyloid 1-40多克隆抗體與抗βAmyloid 1-42多克隆抗體均為1∶500；0.01mol/L PBS充分浸洗后入金標二抗稀釋液中（0.01mol/L PBS，1∶50）孵育3h，0.01mol/L PB充分浸洗后，2％戊二醛（0.01mol/L PB）10min，0.01mol/L PB充分浸洗，入銀增強液3h，0.01mol/L PB浸洗，1％鋨酸（0.01mol/L PB）1h，0.01mol/L PB充分浸洗后依次置于50％酒精10min，70％酒精中待切片。不加一抗作為陰性對照。

組織塊逐級脫水：70％酒精、90％酒精、1/2 90％酒精+1/2 90％丙酮混合液、90％丙酮、100％丙酮，依次間隔15min。

將包埋好的組織塊修剪成塔形，尖端面積0.2mm×0.3mm左右，用超薄切片機切成50μm的切片，置于銅網上。電鏡下，將對比度調到最大時仍可見的黑色顆粒為膠體金。

2 結果

2.1 免疫組化結果（圖1～2見彩插3）

2.1.1 Aβ40的免疫組織化學染色：標記Aβ40的切片中，7歲猴可觀察到神經細胞和膠質細胞中可見有少量的Aβ40顆粒，以額葉和海馬居多（圖1A，B），頂葉次之。老年猴中Aβ40聚集成團狀斑塊（圖1E，F），神經細胞和膠質細胞中也見有Aβ40顆粒（圖1C，D），顆粒密度與年輕猴未見明顯差別，也以額葉和海馬居多。

2.1.2 Aβ42的免疫組織化學染色：標記Aβ42的切片中，7歲年輕猴中細胞內未見明顯的顆粒狀Aβ42（圖2A）。老年猴的額葉切片中可見Aβ42散在的斑塊，多在細胞外（圖2C）；神經細胞和膠質細胞內也見有Aβ42顆粒狀沉積（圖2B）；同時在老年猴的顳葉可見有明顯的Aβ42形成的神經纖維纏結現象（圖2D）。

2.2 免疫電鏡結果（圖3～5見彩插4）

2.2.1 Aβ40的免疫電鏡結果：為了進一步觀察Aβ沉積和分布的超微結構，我們選取23歲的恒河猴腦組織的上述四個部位進行免疫電鏡分析，采用5nm的膠體金顆粒作為二抗。其中標記Aβ40的切片中，膠體金顆粒大部分存在于神經細胞胞漿中，也有少量存在于細胞核中。在細胞間質和小膠質細胞中也可見少量的膠體金顆粒，多見于額葉（圖3）。

2.2.2 Aβ42的免疫電鏡結果：標記Aβ42的切片中，標記上Aβ42的金顆粒比Aβ40的數量偏多。膠體金顆粒也是多見于神經細胞中，在小膠質細胞中也是少量存在，其中細胞外散在的膠體金顆粒數量也較多，多見于額葉和海馬（圖4）。

2.2.3 血管和神經纖維的Aβ沉積：Aβ40和Aβ42也普遍存在與血管內皮細胞周圍，數量頗多；而且在顳葉的神經纖維束中也可見Aβ42標記的膠體金顆粒（圖5）。

3 討論

Aβ是由正常存在于細胞膜上的APP在β和γ蛋白酶的作用下水解形成的4×103左右的蛋白。除了APP基因突變造成的Aβ過量產生以外，Aβ自身的清除和降解代謝障礙也是Aβ沉積的重要原因。一項新的研究顯示，Aβ可以抑制腦中大分子量蛋白酶的活性，從而使Aβ無法降解，這樣Aβ就進入了一個沉積的惡性循環［7］。近年來，越來越多的研究證明，作為SP的核心成分，Aβ可以引起氧化應激、Ca2+內流，進而損傷線粒體，導致神經細胞產能障礙，激活凋亡相關蛋白和因子，最終啟動細胞的凋亡過程。另外，Aβ還可以通過引起腦內炎癥反應和NFT間接導致神經細胞凋亡。神經元凋亡，突觸大量丟失，體現出整體上的神經功能障礙和行為學的改變。

在本研究中，采用免疫組織化學和免疫電鏡方法研究Aβ40和Aβ42與年齡相關的變化特點。最近的研究表明，細胞內Aβ的顆粒狀沉積只存在于老年個體和AD患者，而不存在于年輕非人靈長類動物的大腦［8-11］。然而，在本研究中，我們發現在年輕恒河猴的皮層神經元中也存在細胞內Aβ，并且Aβ40在年輕猴和老年猴中顆粒密度無明顯差別?？赡艿慕忉尵褪潜菊n題組采用了4％多聚甲醛固定組織，并且采用甲酸預處理腦組織，眾所周知，多聚甲醛能夠更好的保留固定組織和細胞表面抗原［12］且定期酸預處理能改善免疫反應。在年輕猴中，Aβ的存在形式更多是自然的顆粒性質，這表明在年輕猴神經細胞中的Aβ是處于生成和降解的平衡狀態中，而不同于在老年猴腦組織中的細胞外積聚斑塊?？傊覀儼l現，在年僅7歲的猴子皮層神經元存在彌漫性顆粒形式的細胞內Aβ，隨著年齡的增長（19～24歲），出現明顯的Aβ神經元簇或斑塊形式，尤以Aβ42更為明顯。年輕猴中細胞內未見明顯的顆粒狀Aβ42，但老年猴的額葉切片中可見Aβ42細胞外散在的斑塊，神經細胞和膠質細胞內也見有Aβ42顆粒狀沉積，并且在顳葉部位還可見明顯的Aβ42NFT。Aβ42在年輕猴和老年猴中差異較大，可能與老年斑的形成過程有密切關系。

另外本研究采用免疫電鏡觀察亞細胞水平上Aβ的分布特點，采用5nm的金標二抗標記［13］，振蕩切片后不經復染直接觀察，在10000×鏡下清晰可見膠體金顆粒。老年恒河猴腦中β淀粉樣蛋白出現于不同的結構中，包括神經元、近端樹突和軸索，也出現于血管周圍和神經纖維中。β淀粉樣肽還可出現于衛星細胞和小膠質細胞中，特別是當老年斑處于活躍狀態時［14］。我們觀察到Aβ40和Aβ42標記的膠體金顆粒均較多存在于神經細胞胞漿中，以額葉部位多見；而Aβ42在血管內皮細胞周圍和神經纖維中也有一定數量。根據以上結果，在組織學和亞細胞學水平觀察Aβ，均在額葉和海馬部位發現較多沉積，并且在顳葉均標記出神經纖維纏結，Aβ的神經毒性作用以及由此產生的認知功能障礙可能與Aβ沉積部位有密切關系。額葉影響學習到的運動活動和表達行為，海馬與記憶的形成和抑郁有關，顳葉的活動涉及視覺辨認、聽覺感知、記憶與情緒，由此可見若Aβ在上述部位有較多沉積并產生神經毒性作用，阻斷了神經軸突之間的信號傳導，甚至導致神經細胞鈣超載發生細胞凋亡［15］，必將影響認知功能。實驗證明，二十多歲的老年猴能呈現類似人類的老年化行為和機體的退變，例如行動遲緩，記憶力減退，血管硬化等［16］。如何將恒河猴中Aβ的變化特點與臨床AD患者的Aβ特點進行相關性聯系，還需要有一系列工作要做，這也能夠為臨床上AD確診和藥物臨床應用提供更恰當的依據。

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