實驗動物屏障系統微生物動態狀況

柯賢福,周莎桑,樓 琦,盧領群,戴方偉,薩曉嬰

(1.浙江大學動物科學學院,杭州 310029;2.浙江省醫學科學院省實驗動物中心,杭州 310013)

研究報告

實驗動物屏障系統微生物動態狀況

柯賢福1,2,周莎桑2,樓 琦2,盧領群2,戴方偉2,薩曉嬰2

(1.浙江大學動物科學學院,杭州 310029;2.浙江省醫學科學院省實驗動物中心,杭州 310013)

目的研究運行中的實驗動物屏障系統微生物的情況。方法采用沉降菌法、棉拭子法等方法,研究運行中的屏障系統不同區域、不同環境指標下屏障系統內微生物的狀況。結果動態下的屏障系統微生物情況與國標 GB14925-2001中靜態環境有較大不同,動物飼養室和動物實驗室沉降菌濃度遠高于靜態要求;輔助區域在規范化消毒及嚴格管理的情況下,能達到國標要求。屏障系統的微生物情況存在一定的晝夜變化規律,在晚間出現峰值。結論合適的換氣次數可有效控制實驗動物屏障系統的沉降菌濃度;加強消毒及硬件的管理,是屏障系統內環境穩定的保障。

微生物;沉降菌;檢測;環境;實驗動物

實驗動物環境設施的國家標準主要針對的是靜態下的實驗動物設施[1],而運行中的實驗動物設施內微生物的攜帶情況,國家標準未作明確規定,相關研究也不多見。本研究通過幾種不同的方法觀察實驗動物設施的動態微生物變化情況,以期發現微生物變化的規律并為實驗動物設施管理提供依據。

1 材料和方法

1.1 屏障系統設施情況

屏障環境動物實驗室,面積 500 m2,單走廊結構。動物實驗區共 8個動物實驗室,為全新風模式;輔助功能區域包括內準備間、潔具室、清潔走廊、二更、緩沖等,為回風部分再利用模式(圖 1)。實驗期間,該設施環境參數控制如下:溫度 20℃～24℃,相對濕度 60%～70%,噪音 <60 dB,相鄰房間梯度壓差 15～20 Pa,空氣潔凈度 7級 (輔助區域),晝夜明暗交替時間 12 h/12h。

圖 1 屏障環境動物實驗室平面布局圖Fig.1 The ichnography of animal lab

1.2 檢測儀器和試劑

BCJ-1型激光塵埃粒子計數器 (江蘇省吳縣市華達儀器設備廠);475-000-FM手持式數字壓差計(美國Dwyer);Testo608-H1型溫濕度表 (德圖儀表有限公司);SPX-150BS-II型生化培養箱 (上海新苗醫療器械制造有限公司);營養瓊脂培養基 (杭州微生物試劑有限公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 棉拭子法:采用拭子法[2],檢查屏障系統各個功能區域的墻壁、地面、飼養器械等表面的微生物分布情況。主要包括:一更、二更、鞋柜、無菌衣柜、風淋室、緩沖間、傳遞窗、內準備間、清潔走廊、動物實驗室等。于環境消毒處理前、后分別進行采樣。用 5 cm ×5 cm的標準滅菌規格板,放在被檢物體表面,采樣面積≥100 cm2,連續采樣 4個,用浸有含中和劑的無菌洗脫液的棉拭子 1支,在規格板內橫豎往返均勻涂擦各 5次,并隨之轉棉拭子,剪去手接觸部位后,將棉拭子投入 10 mL含中和劑的無菌洗脫液試管內,立即送檢。

將采樣管在混勻器上振蕩 20 s或用力振打 80次,用無菌吸管吸取1.0 mL待檢樣品接種于滅菌平皿,每一樣本接種 2個平皿,內加入已溶化的 45℃～48℃的營養瓊脂 15～18 mL,邊傾注邊搖勻,待瓊脂凝固,置 37℃培養 48 h,計數菌落數。

1.3.2 沉降菌法:采用沉降菌法,用普通營養瓊脂進行落下菌的測定。培養基經過高壓滅菌器滅菌后倒入直徑 9 cm的一次性平皿內,4℃保存。沉降菌檢測時,分別于不同的功能區域擺放平皿,30 min后進行 37℃培養 48 h,計數菌落數。

布點方法:室內面積≤30 m2,設內、中、外對角線 3點,內、外點布點部位距墻壁 1 m處;室內面積>30 m2,設 4角及中央 5點,4角的布點部位距墻壁1 m處。

采樣方法:將普通營養瓊脂平板放在室內各采樣點處,采樣時將平板蓋打開,扣放于平板旁,暴露30 min,蓋好立即送檢。采樣期間,禁止人員走動。

2 結果

2.1 棉拭子法測試不同區域細菌情況

采用棉拭子的方法,分別于消毒前后從傳遞倉、內準備間、二更、清潔走廊、沙鼠室、大鼠室及空實驗室的墻壁進行采樣。動物實驗室的墻壁所攜帶菌落數顯著高于輔助區域 (P<0.05);沙鼠實驗室的菌落數顯著高于大鼠實驗室 (P<0.05)。消毒前后的比較,輔助區域菌落數有減少的趨勢,而動物實驗室則顯著降低。空實驗室因未飼養動物且保持通風狀態,故潔凈狀態前后較為一致,菌落數較少(表 1)。

表 1 棉拭子法不同區域細菌情況Tab.1 The number of bacteria among different areas by swab test

2.2 沉降菌法消毒前后不同區域菌落數比較

采用沉降菌測試法,連續監測不同區域 (動物實驗室、輔助區域)消毒前后的沉降菌濃度變化情況。沙鼠和大鼠實驗室的沉降菌濃度隨著時間的變化呈現一定的變化規律,均在晚上 21時至 24時出現峰值,且沙鼠實驗室的沉降菌數始終高于大鼠實驗室 (圖 2)。輔助區域在消毒后菌落數有所降低,除清潔走廊外,空實驗室、內準備間、二更、緩沖均能始終維持在國標中靜態環境所要求的 3 cfu/皿,φ9 cm,30 min以內(圖 3)。

圖 2 動物實驗室沉降菌濃度變化情況Fig.2 Airfall bacteria number of animal lab

圖 3 輔助區域沉降菌變化情況Fig.3 Airfall bacteria number of functional areas

2.3 不同換氣次數下沉降菌濃度的比較

在保持相同動物密度及梯度壓差等指標相對一致的情況下,先后設置動物室換氣次數為 10次/h、15次/h,觀察各動物實驗室及輔助區域沉降菌濃度的變化情況。輔助功能區及空實驗室沉降菌濃度未見明顯差異,但數量均較少,且在國標范圍內;沙鼠室和大鼠室在 15次/h的換氣次數下,沉降菌濃度顯著降低 (P<0.05)(圖 4)。

圖 4 不同換氣次數下各區域沉降菌情況Fig.4 Airfall bacteria of different ventilation rate among different areas

3 討論

實驗動物的環境是封閉式人工環境,包括氣候因素(溫度、濕度、風速等)、物理化學因素 (換氣次數、塵埃粒子、噪音、照度等)、生物因素 (微生物等)等。實驗動物的環境因素對動物實驗的結果產生重要的影響。進行動物實驗時,為了保證實驗結果的穩定性與可靠性,需要盡可能的控制這些影響因素。動物室空氣中浮游著通過動物和人或飼養籠器具帶進來的細菌、病毒、立克次體等。這些微生物在適當的溫、濕度和營養條件下會迅速增殖。病原性微生物污染動物室后,會造成動物繁殖效果差和動物實驗的混亂乃至動物死亡。因此,屏障系統的運行過程中,動物進入要先進行檢疫,人員進出需洗手、淋浴、更衣,空氣則要經過三級過濾,籠器具及實驗器材要進行滅菌、消毒后方可使用,即用各種手段防止微生物侵入動物室內,使設施的內環境保持相對獨立。

動物室的空氣中細菌數目是反應設施中微生物污染程度的一個重要指標。空氣中細菌檢測分靜態和動態兩種。設施啟用前的沉降菌檢測屬于靜態檢測,目的是了解設施是否具備維持飼養動物所需的充分的清潔度的性能。由于是沒有飼養動物的狀態,故其測定的結果變化因素少[3];而作為飼養動物狀態下動物室的潔凈情況的檢測,動態細菌監測對于了解屏障設施的運行狀態,監控內環境的清潔程度有著重要的意義。動態監測是在飼養動物狀態下進行的,其測定結果因溫度、濕度、換氣次數、飼養密度、籠盒結構、墊料、動物活動期、人員工作時期、采樣地點等因素的變化而有較大的變動。

通過棉拭子法可看出,動物設施的墻壁及地面附著大量的微生物,尤其是動物飼養室和動物實驗室,因為動物的活動,使得微生物數量遠多于沒有動物的輔助區域。因此,加強對環境的消毒是必要的,且在消毒過程中,不可忽視對墻壁、屋頂的擦拭、噴霧,還應經常用消毒藥水拖地,這些部位都是容易滋生細菌的地方。

動物有其較為固定的活動周期,故動物室的沉降菌濃度也隨之呈現一定的變化規律。動物晚間活動較為頻繁,從而導致夜間動物室的空氣質量相對較差,空氣中的細菌數也明顯增加,尤其是晚上 21時至凌晨零時表現更為突出。此外,在上午工作人員進行實驗操作期間,沉降菌濃度也呈現較為明顯的升高,幾乎達到全天峰值。屏障系統中,人員的進入和操作活動室污染屏障潔凈環境的最大污染源[4]。建議考慮在上述時間段采用增加換氣次數的方法來改善動物室空氣質量,同時便于將大量產生的細菌攜帶出屏障設施之外,以保證室內的潔凈情況。

屏障系統動物實驗室多為亂流,其室內氣流有一部分要循環流動,因此,動態環境下,亂流屏障系統動物實驗室的細菌是較難控制的[5]。適當的增加換氣次數,能供給動物新鮮空氣,對除去動物室內惡臭物質有重要作用,也與粉塵、微生物的控制有直接聯系。15次/h的換氣次數下,大鼠實驗室、沙鼠實驗室的沉降菌濃度分別降低 48.7%、44.7%,因此,建議動物實驗室的換氣次數應不低于 15次/h。

輔助區域 (二更、緩沖、內準備、清潔走廊)的微生物攜帶情況遠遠好于動物實驗室,其沉降菌濃度基本均在靜態國標要求的 3 cfu/皿以內。這也說明屏障系統通過合理消毒與嚴格管理,是可以有效保持其微生物潔凈狀況的。同時可看出,清潔走廊的沉降菌濃度始終高于其它輔助區域,且間斷出現超過 3 cfu/皿的情況,初步認為有兩方面原因:一是本屏障系統為單走廊結構,污潔的籠具、人員、動物、物品均需通過該區域,從而造成清潔走廊從空間上無法劃分潔污流線,只能依靠時間差來區分,勢必會造成該區域潔凈情況稍差[6];二是該區域與動物實驗室相鄰,動物室相對于清潔走廊為正壓,部分空氣會壓入到該區域,而室內的沉降菌數遠高于走廊,故引起其沉降菌濃度有所增加。但清潔走廊的沉降菌濃度遠低于動物室,管理到位的情況下,能控制在較低水平。能否據此將清潔走廊的沉降菌情況作為間接反映實驗動物屏障系統動態微生物狀況的一個參數,值得進一步的探討。

[1] 國家質量技術監督局 .GB14925—2001,實驗動物環境及設施[S].

[2] 孫俊,周明浩,徐燕,等.消毒技術與應用[M].北京:化學工業出版社,2003:346-347.

[3] 薛敬禮,杜春燕,王純耀,等.實驗動物環境設施技術指標的探討[J].中國比較醫學雜志,2006,16(6):362-364.

[4] 尹松林,傅江南,王洪軍,等.實驗動物獨立通氣籠盒系統設計與應用[M].北京:人民軍醫出版社,2008:23.

[5] 宗阿南,史曉萍,福山侑榮,等.屏障系統動物室單向流與亂流空氣凈化方式的細菌比較分析[J].中國比較醫學雜志, 2007,17(8):476-477.

[6] 何婧,沈晉明.實驗動物設施的污染控制與布局[J].潔凈與空調技術,2005,1:34-40.

Dynam ic Status of Germ in Laboratory An imals'Barrier System

KE Xian-fu1,2,ZHOU Sha-sang2,LOU-Qi2,LU Ling-qun2,DA I Fang-wei2,SA Xiao-ying2
(1.College ofAnimal Sciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310029,China; 2.Center ofLaboratoryAnimal,ZhejiangAcademy ofMedical Sciences,Hangzhou 310013,China)

ObjectiveTo study the dynamic situation of ger m about laboratory animals'barrier system。MethodsUsing cotton pledget to test the concentration of bacteria in different area of barrier system,aswell as through themethod of airfall bacteria。ResultsThe results showed that in dynamic enviroment,especially in animal laboratory rooms,the airfall bacteria was farmore than static condition which has been l imited below 3cfu/dish in the National Standards forLaboratory An imal Environment and Facility(GB14925-2001),but in functional rooms the condition was so good that could meet the demand of national standard under the situation that the barrier could be normally sterilized and be managed well.We also found that the airfall bacteria of barrier had regulation that usually had a peak value from 21:00 to 0:00。Conclusions Suitable ventilation rate,possible enviromental disinfection and good management can make the inner environment of laboratory an imal barrier system steady.

Microorganis ms;Airfall bacteria;Test;Enviroment;Laboratory animal

R-33

A

1671-7856(2010)03-0047-04

2009-11-03

浙江省實驗動物科技計劃項目(編號:2007F80009)。

柯賢福(1980-),男,助理研究員,碩士研究生,研究方向:實驗動物質量檢測與動物實驗。

薩曉嬰(1952-),男,研究員,研究方向:實驗動物科研及管理。E-mail:saxiaoyin@163.com