S W1990和 Capan-2紅色熒光標記胰腺癌移植腫瘤模型的建立和比較

李小穎,蘇 衛,張連峰

(中國醫學科學院實驗動物研究所北京協和醫學院比較醫學中心,衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

研究報告

S W1990和 Capan-2紅色熒光標記胰腺癌移植腫瘤模型的建立和比較

李小穎,蘇 衛,張連峰

(中國醫學科學院實驗動物研究所北京協和醫學院比較醫學中心,衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

目的建立穩定表達紅色熒光蛋白基因的人胰腺癌細胞系,為體內監測腫瘤的早期生長及抗腫瘤藥物的藥效評價建立一種新的腫瘤動物模型。方法以 Lipofectamine 2000介導 chickenβ-actin-RFP-NEO轉染人胰腺癌細胞 S W1990和 Capan-2,經梯度濃度 G418篩選獲得穩定表達紅色熒光蛋白的細胞克隆并擴大培養。BALB/ cA-nu裸鼠皮下接種 1×106個發光細胞使其成瘤,活體熒光成像系統觀察腫瘤的生長情況。結果獲得了穩定表達 RFP的兩種不同的人胰腺癌細胞株,將其接種到裸鼠體內可成瘤,利用活體成像系統觀察了腫瘤的生長動態過程,并且 S W1990腫瘤細胞的生長速度較 Capan-2細胞快。結論用紅色熒光蛋白標記的人胰腺癌細胞建立的裸鼠腫瘤模型為胰腺癌的研究和相關藥物篩選提供了可進行熒光影像活體、動態分析的動物模型。

人胰腺癌細胞;紅色熒光蛋白;活體熒光成像系統

腫瘤細胞系 S W1990和 Capan-2均為源于男性白人的胰腺癌細胞,組織培養,呈現上皮樣細胞特征;接種裸鼠后,組織病理學上類似于原發癌,腫瘤呈現高分化的腺癌樣生長[1,2]。人胰腺癌細胞株S W1990為高轉移人胰腺癌細胞株,1978年取自一名 58歲胰尾癌并脾轉移的男性患者,CEA陽性, 1979年患者死于肝轉移。S W1990由美國學者Kyriazis等建株[1]。人胰腺癌細胞株 Capan-2取自胰腺導管腺癌,產生高水平粘蛋白 MUC-1的mRNA,低水平粘蛋白MUC-2的mRNA但是不表達粘蛋白MUC-3基因.目前國內外學者主要集中于胰腺癌轉移機制的研究[3-7]。

本實驗利用紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein,DsRed)基因分別標記 S W1990和Capan-2腫瘤細胞,結合光學影像分析技術,連續、動態地觀察和比較兩種不同的人胰腺癌細胞在裸鼠皮下生長及形成瘤體的過程,建立了光學腫瘤模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器:人胰腺癌細胞 S W1990和Capan-2本實驗室凍存,L-谷氨酰胺 (G IBCO公司)、雙抗(G IBCO公司)、DMEM(G IBCO公司)、胎牛血清 (G IBCO公司 )、G418(AMRESCO公司 )、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogene公司 )。Whole-body optical imaging system (I.C.E.,日本Roper公司)、倒置熒光顯微鏡(OLY MPUS IX71)、倒置顯微鏡 (Nikon TS100)。

1.1.2 實驗動物:BALB/cA-nu裸小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[XCXK(京)2007-0001],鼠齡 5周,體重 15～18 g,在本實驗室無特定病原體 (specific-pathogen free,SPF)的飼養間飼養。所有實驗操作程序均經過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準 (批準號為 GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:用含 10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素的 DMEM培養基作為S W1990和 Capan-2細胞的培養液,于 5%CO2,37℃細胞培養箱內常規培養。

1.2.2 構建帶有篩選標記的載體:chickenβ-actin-RFP由本實驗室構建[8,9]。

1.2.3 細胞轉染和篩選:采用 Lipofectamine 2000 Reagent轉染 S W1990和 Capan-2細胞 (具體轉染步驟參照 Lipofectamine 2000 Reagent操作說明)。轉染后 24 h,用含 1000μg/mL G418的培養液篩選細胞 3周,獲得穩定表達 RFP的細胞株,選擇其中高表達的克隆株擴大培養。

1.2.4 腫瘤細胞的植入及活體熒光成像:收集處于生長對數期的轉染細胞,稀釋至 5×106/mL。各取三只BALB/cA-nu裸鼠進行皮下接種,1×106個細胞/只,每隔一周觀察一次,飽和三溴乙醇 (0.18 mL/10 g)麻醉后放入活體熒光影像系統攝像,Slide Book 4.0軟件進行分析。

2 結果

2.1 穩定高表達D sRed的細胞株克隆

S W1990和 Capan-2采用脂質體 2000轉染,用含 1000μg/mL G418的培養液篩選細胞三周,獲得穩定表達 RFP的細胞株。穩定高表達 DsRed的兩種細胞,在熒光顯微鏡下均呈強熒光,并且熒光較均勻的分布于整個細胞內。單克隆 DsRed細胞在無 G418篩選壓力下,傳代數次后仍能穩定高水平表達DsRed(圖 1,彩插 1)。細胞形態和未轉染細胞無明顯區別。

2.2 D sRed熒光標記 SW 1990和 Capan-2小鼠腫瘤模型的動態觀察

分別將對數生長期的DsRed標記的 S W1990和Capan-2腫瘤細胞皮下接種于 3只 BALB/cA-nu,1 ×106/只。在接種后的 7、14、21、28和 35 d觀察腫瘤的生長情況。在接種的第 7天就可以觀察到腫瘤熒光,通過腫瘤組織發出的熒光的光子數確定腫瘤的大小,隨著觀察天數的增加,腫瘤的體積和發光強度增加,且具有很好的相關性 (圖 2和圖 3,彩插2)。以腫瘤細胞發射的光子數對小鼠荷瘤時間作圖得到熒光蛋白標記的兩種不同腫瘤細胞在裸鼠體內的生長曲線 (圖 4),發現 S W1990腫瘤明顯比Capan-2快。

3 討論

DsRed是紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein, RFP)的一種,是從印度洋-太平洋中海葵相關的Discosoma sp中分離得到的生物發光蛋白,相對分子質量為 28×103。它能在紫外線激發時發出紅色熒光,其最大激發波長為 558 nm,最大發射波長為583 nm,且發射峰位于培養基、組織培養玻璃器材及細胞成分等產生的熒光背景范圍之外[10]。RFP能在哺乳動物細胞中高效表達,可用于示蹤活細胞內基因表達調控、蛋白質轉運及蛋白質之間的相互作用等。與綠色熒光蛋白各種變異體比較,DsRed能提供更高的信噪比。而且,由于 DsRed為長發射波長,故細胞中熒光轉換效率更高,較短發射波長的綠色和藍色熒光信號更為清楚。與其他報告基因比較,DsRed具有觀察方便、靈敏度高、對極端 pH值和光漂白抗性強、定性和定量測定方便等特點,因而日益受到關注。

圖 4 紅色熒光標記兩種胰腺腫瘤的生長曲線Fig.4 Thegrowthcurve of Capan-2-DsRedand S W1990-DsRed in vivo

活體動物體內光學成像技術對疾病動物模型微小病灶的檢測靈敏度極高,該技術能夠進行無創、實時、動態的動物活體觀察,從而對同一實驗對象進行不同時間點的觀察,減少實驗動物個體間差異,與傳統的實驗方法相比,可以大大減少動物的用量,符合替代、減少、優化的“3R”原則。本實驗中將強啟動子 chickenβ-actin啟動的 RFP基因轉染到人胰腺癌細胞株 S W1990和 Capan-2中得到了高表達DsRed熒光蛋白細胞株。經過多次傳代表達水平穩定,標記細胞的形態、生長方式、生長速度及致瘤能力等與未轉染細胞無明顯差異,可以反映S W1990和 Capan-2腫瘤細胞生物學行為的標記細胞,其他標記細胞的研究報道也證實了類似的結果[11]。將 RFP標記的兩種人胰腺癌細胞經皮下接種至BALB/cA-nu裸鼠,用活體熒光成像系統連續觀察,發現能夠成瘤,并且腫瘤的體積與發光強度有相關性,建立了一種新的能夠用于活體內連續監測腫瘤生長的動物模型。此癌癥模型利用無創傷活體熒光成像對癌細胞生長的檢測,可對癌癥治療之前和過程中的癌細胞的變化進行實時觀測和評估,可應用于癌癥體內用藥的療法中。另外,從兩種不同腫瘤細胞在裸鼠體內的生長曲線發現S W1990腫瘤細胞的惡性程度遠遠高于 Capan-2腫瘤細胞,S W1990高肝轉移的人胰腺癌細胞株具有侵襲力強、轉移效率高和轉移范圍廣的特點,常用來深入研究胰腺癌肝轉移機理的理想細胞系[12-15]。綜上,活體成像系統具有較高的靈敏度,能夠客觀評價 S W1990-Ds Ded和 Capan-2-DsRed細胞在裸鼠體內的生長情況,為成像系統在胰腺癌的發展機制、藥物治療、基因治療等方面的研究提供重要的參考依據。

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The Establishment and Comparison of TwoM ouse Transplanted Tumor M odels with D sRed-labeled SW1990 and Capan-2 Human Pancreas Cancer CellL ines

L IXiao-ying,SU Wei,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratoryAnimal Science, Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&ComparativeMedicine Centre,PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish DsRed-labeled human pancreas cancer cell lines and to generate a noninvasive model for monitoring tumor growth in vivo.M ethod Human pancreas cancer cells of S W1990 and Capan-2 were transfected with chickenβ-actin-DsRed-neo byLipofectamine 2000 reagent and screened with G418 to produce the stable DsRed-expressing clone.Then the labeled S W1990 and Capan-2 cellswere implanted into the subcutaneous tissue of nude mice and the growth of the implanted tumorwas observed and analyzed with the whole-body optical imaging system.Result The stable DsRed-expressing S W1990 and Capan-2 cell lines were established and the cell line was used to duplicate the implanted tumormousemodel.The growth of the tumormasswith red fluorescentprotein labeled S W1990 and Capan-2 was observed after inoculation of the cells below dorsal blank ofBALB/cA-nu。ConclusionThe implanted tumormousemodel ofDsRed-labeled S W1990 and Capan-2 cell was established,which was a convenient model for the dynamic and in vivoresearch on the human pancreas cancer and drug discovery.

Human pancreas cancer cell;Red fluorescent protein;Whole-body optical imaging system

R541

A

1671-7856(2010)03-0012-03

2009-09-15

衛生部行業基金,實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

李小穎,實習研究員,主要研究方向:人類疾病動物模型。

張連峰。E-mail:zhanglf@cnilas.org