兩種 HSV-1及猴B病毒相關抗體測定方法的比較

(中國醫學科學院中國協和醫科大學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

喬紅偉,佟 巍,蔣 虹,叢 喆,王 衛,魏 強

技術方法

兩種 HSV-1及猴B病毒相關抗體測定方法的比較

(中國醫學科學院中國協和醫科大學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

喬紅偉,佟 巍,蔣 虹,叢 喆,王 衛,魏 強

目的以人單純皰疹病毒(HSV-1)做為抗原,利用空斑法和 IFA法比較猴BV和人 HSV-1陽性血清兩種不同血清的中和能力的差異,建立一種實用、準確、可靠的病毒毒力的檢測方法。方法首先,將 HSV-1病毒懸液作連續的10倍稀釋,取1 mL接種于已經長成單層的Vero-E6細胞上,用1%甲基纖維素覆蓋,待其出現蝕斑后計數,算出病毒懸液中每毫升所含蝕斑單位,即滴定出 HSV-1的 TC ID50。同時,用免疫熒光方法 (IFA)對猴和人皰疹陽性血清進行滴定,得到其血清的效價。其次,用滴定出的病毒液分別與兩種陽性血清體外中和后,接種到單層的Vero-E6細胞上,用 1%甲基纖維素覆蓋,待其出現蝕斑后計數。最后,計算出其蝕斑減少率。結果用 1%甲基纖維素作覆蓋層的蝕斑數量平均為 10-5PFU,能形成 115～116個/mL蝕斑,形狀呈黍米大小的規則圓形,其蝕斑邊緣清晰。IFA滴定的人 HSV-1陽性血清與猴BV陽性血清的中和抗體均為 1∶80。人 HSV-1和猴BV兩種陽性血清的空斑減少率均為 100%。結論確定了利用 1%甲基纖維素做為覆蓋層可得到清晰可靠的蝕斑,由此方法檢測到用人HSV-1可以代替猴B病毒,篩查猴B病毒抗體。且為將來進行藥物篩選和中和實驗中利用病毒空斑法建立方便、可靠的方法。

獼猴皰疹病毒 1型;人單純皰疹病毒Ⅰ型;空斑減少;免疫熒光

猴皰疹病毒 (Simian Herpes Bvirus)也稱 B病毒,屬皰疹病毒科。1934年,Sabin等首次從被咬傷致死的人腦和脾中分離得到,獼猴為自然宿主。人類感染B病毒主要表現為致死性腦脊髓炎,并發生死亡。目前,我國國標要求用 B病毒檢測猴血清,但生物安全要求高等級實驗室中進行,以往主要使用與B病毒密切相關的單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)作抗原,檢測猴群中 B病毒感染的情況,起到積極意義。文獻報道我國猴群中 BV抗體陽性率高達10%～60%[1]。1997年我國分離得到了 1株 B病毒,命名為BV147[2],但由于BV操作要在生物安全4級實驗室(ABSL-4)進行,目前我國還沒有建立此實驗室,因此尋找一種安全的替代方法非常必要。

我國研究人員已經成功建立了免疫熒光法(F IA)和免疫酶法 (E IA)對 BV陽性抗體進行了檢測[3]。蝕斑技術可以準確測定病毒懸液中感染病毒的含量,由于特異性抗體能夠抑制病毒產生蝕斑,可以用蝕斑技術測定動物血清和其它體液內的中和抗體,即產生蝕斑抑制現象。細胞病變實驗參照常規方法,本實驗在原有的蝕斑實驗的基礎上進行了改進,即用人 HSV-1抗體陽性血清和猴BV抗體陽性血清體與人 HSV-1體外中和后,改用 1%甲基纖維素作為覆蓋層,檢測其對敏感細胞產生的蝕斑減少數目,能形成肉眼可見的清晰的蝕斑,從而確定這種方法的可靠性。

1 材料和方法

1.1 細胞和病毒存儲液

VeroE6非洲綠猴腎細胞 (本室保存,引自美國ATCC)用于 HSV-1的培養和中和試驗。HSV-1抗原片由本室制備,人 HSV-1毒株、猴 B病毒感染陽性血清由本室保存,人單純皰疹病毒陽性血清由某醫院健康體檢人群篩查獲得。HSV-1病毒存儲液的制備:用DMEM高糖細胞培養液(含有100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素、2 mmol/L L-谷胺酸和10%胎牛血清)在細胞瓶中培養 VeroE6細胞,長成單層后接種 HSV-1病毒,病毒在 VeroE6細胞上繁殖到 0.01 MO I(感染復數)時,反復凍融,離心收集上清液,用 0.22μm的濾器過濾,于 -80℃保存備用。將病毒存儲液 1∶10梯度稀釋,在長成單層VeroE6細胞的 96孔細胞培養板上滴定,2×105細胞/孔時,在接種第 4天時,觀察細胞病變 (用MTT法)計算出其 TC ID50,計算出 HSV-1的 TC ID50是10-5。2%甲基纖維素 (4000cP;Sigma,MC)配制,稱取 8.8 gMC用 320 mL的三蒸水溶解,用磁力攪拌器進行攪拌。溶解后,在 121℃高壓 30 min,用前與等體積的 2×DMEM混勻即可。PBS(pH7.2),4%多聚甲醛,0.5%結晶紫。12孔組織培養板,96孔 U型組織培養板 (Corning,NY),單道和多道微量加樣器,Tip頭。所有涉及到活病毒及感染細胞的培養到要在生物安全柜內進行。潔凈工作臺,5%CO2的 37℃細胞培養箱,37℃恒溫培養箱,-70℃冰箱,倒置顯微鏡。

1.2 HSV-1和 BV陽性血清免疫熒光法檢測

用含10%牛血清 PBS封片,即用10%牛血清滴加所有抗原孔,包括正常抗原孔和病毒抗原孔,滴加好的玻片馬上放入濕盒內,于 37℃孵育 0.5 h。取出玻片,用 PBS洗 3次,每次浸泡 5 min。玻片自然干燥,待檢血清 56℃孵育 0.5 h滅活后,1∶10稀釋,滴加至檢測抗原孔內,同時做陽性血清和陰性血清對照,滴加時應避免交叉串孔,滴加好的玻片應馬上放入濕盒內,于 37℃孵育 0.5 h。取出玻片,用 PBS洗3次,每次浸泡5 min,期間輕輕震搖數次。待玻片干燥,各檢測孔滴加熒光結合物 (用前稀釋),放入濕盒內 37℃孵育 0.5 h。玻片用蒸餾水漂洗 2次,在用 50%甘油封片后,即可在熒光顯微鏡下觀察結果。

1.3 空斑實驗及空斑減少實驗

在 12孔組織培養板中用空斑實驗檢測 HSV病毒的噬斑形成單位 (pfu)。將 VeroE6細胞 (平均每孔 0.5×106個細胞)接種到 12孔組織培養板上。在 37℃5%CO2培養,培養 24 h后用于接種。在 96孔U型板中,用 100μL的 SCV的 50 pfu(相當于 16 000TC ID50),與不稀釋或者進行系列稀釋的血清進行中和,37℃孵育 1 h。棄去 12孔培養板中培養液,取上述孵育好的混合液 100μL加入到培養好的 12孔板的VeroE6細胞中在 37℃孵育 1 h。用無血清DMEM洗板。用 1 mL的 1%甲基纖維素覆蓋單層細胞,在 37℃孵育 2 d。棄去上清,用 PBS洗板。加入 250μL/孔預冷的 4%多聚甲醛在室溫下作用30 min。棄去 4%多聚甲醛溶液,用 PBS洗板 2次。單層細胞用 300μL的 0.5%結晶紫在室溫下染色5 min。用蒸餾水洗板 2次。培養板在空氣中干燥后,進行空斑計數。

2 結果(圖 1～4見彩插 9)

2.1 HSV-1免疫熒光檢測結果

利用間接免疫熒光 (IFA)方法,用 HSV-1制備的細胞抗原片,對人 HSV-1和猴BV陽性血清進行抗體檢測。陽性血清 10、20、40、80、160倍稀釋的工作濃度下,在血清濃度稀釋到 80倍時仍可以觀察到免疫熒光,且人和猴血清的熒光強度和數量基本相同(圖 1)。

2.2 HSV-1空斑實驗結果

利用空斑減少 (PRNT)方法,對 HSV-1進行滴定,確定其最佳空斑計數濃度為 10-5,其空斑的數量平均為 115個/mL。用確定的病毒液濃度分別與在 1∶10稀釋的基礎上進行 2倍梯度稀釋的人和猴的陽性血清體外中和后,作用于培養好的單層VeroE6細胞,同時做細胞和病毒對照。最后進行空斑計數,計算空斑減少率均為 100%(圖 2,圖 3)。空斑結構清晰可見(圖 4)。

以 HSV-1為抗原,分別用 IFA和 PR檢測后結果進行比較,IFA的方法只能檢測到血清稀釋為1∶80,而 PRNT的結果可以檢測到 1∶105。

3 討論

中國恒河猴做為主要的非人靈長類實驗動物,不僅在我國的新藥和各種疫苗的研制中具有重要的作用,而且在世界各國科研,特別是 H IV/A IDS的研究中有著不可替代的作用[3,4]。由于 BV感染是人獸共患病,除了干擾實驗研究,還能引起實驗人員的感染和死亡,因而對其病原的檢測越來越受到重視。自 1989年吳小閑等[5]成功研制 HSV-1 F IA和 E IA方法以來,國內主要采用該方法檢測實驗用恒河猴血清中BV相關抗體,此方法為實驗用BV陰性猴的篩選和養殖廠猴群體凈化的工作起到了很大的促進作用[6]。

根據文獻,本實驗成功改進了皰疹病毒感染Vero-E6細胞后傳統的空斑減少實驗的方法,利用甲級纖維素作為固相支持物。我們發現甲基纖維素的分子量對空斑的形成非常重要。當加入含有1%甲基纖維素 4000CP的維持培養基做為覆蓋層時,能產生肉眼可見的蝕斑。但是,當使用其它高分子量或低分子量的甲基纖維素混合物時,就不能得到預期的結果。此方法能應用到產生空斑比較難的病毒空斑減少實驗中,也可以不用更復雜的分子或生物化學方法去定量分析皰疹病毒滴度的監測。一個重要的因素就是在這個實驗中可以根據病毒不同的量進行本實驗。其次,我們比較了兩種方法抗體檢測的結果,發現 IFA和 PRNT法檢測結果完全吻合,說明二者都能有效監控 BV抗體的變化,但這兩種方法各有優劣。采用 IFA法能清楚地看到被 BV感染的細胞數量,此方法的缺陷是檢測水平和檢出率的高低受操作人員技術影響較大。PRNT方法也有其缺陷,有文獻證明[7],應用此方法成功的對痘苗病毒、麻疹病毒和狂犬病病毒進行了病毒感染和體外中和作用的研究。證明空斑減少實驗檢測的中和抗體滴度要低于中性紅法和 CPE實驗結果。利用病毒的MO I是 0.032可以進行空斑減少實驗,而中性紅和CPE實驗MO I的量只需要達到 0.02。可以觀察到對于抗痘苗病毒的中和抗體的空斑減少實驗和生物標記實驗不同中和滴度。因此,空斑減少實驗對于高滴度和低滴度的抗病毒抗體都有細微的區別。空斑減少實驗的優點是肉眼可見,且空斑實驗用細胞板可以保存很長時間。

一直以來,我國都是應用與B病毒具有密切的抗原關系的人單純皰疹病毒 (HSV-1、HSV-2)中的HSV-1為抗原,進行玻片免疫熒光和免疫酶染色發進行檢測[5]。1997年田克恭等[8]從我國野生恒河猴口腔潰瘍灶中分離到一株 B病毒,并研制了新的BV抗原片。韋毅等[9],饒軍華等[10]、盤寶進等[11]已經對目前BV檢測試劑盒和方法進行了各種研究和相互之間的比較。目前國內在猴BV抗體初篩檢測方面主要還是使用 HSV-1的免疫酶和免疫熒光,同時結合BV抗原 EL ISA試劑盒附件。因此,為了保證檢測結果的準確性,尤其是對進出口實驗用猴的檢驗,建議同時使用 HSV-1抗原片和 PRNT空斑減少實驗檢測猴 BV抗體,以免漏檢而帶來不必要的經濟損失。

[1] 田克恭.實驗動物病毒性疾病[M].北京:農業出版社, 1992:373-380.

[2] 田克恭,藺會云,遇秀玲,等.PCR在猴B病毒鑒定中的應用研究[J].中國實驗動物學報,2001,4(9):213-215.

[3] 盧耀增,吳小閑,涂新明,等.猴免疫缺陷病毒(S IV)猴模型的建立[J].中國實驗動物學報,1994,2(2):94-102.

[4] HessellAJ,Hangartner L,Hunter M,et al.Fc receptor but not complement binding is important in antibody protection against H IV[J].Nature,2007,449(7158):101-104.

[5] 吳小閑,蔣虹,曲立榮,等.恒河猴B病毒相關抗體檢測方法的比較[J].病毒學雜志,1989,(1):80.

[6] 魏強.我國實驗獼猴的研究及質量標準初探[J].中國比較醫學雜志,1996,1:10-12.

[7] Wang SX,Sakhatskyy P,W.Chou TH,et al.Assays for the assess ment of neutralizing antibody activities against SevereAcute Respiratory Syndrome(SARS)associated coronavirus(SCV) [J].J ImmunMeth,2005,301(1-2):21-30.

[8] 田克恭,藺會云,遇秀玲,等.我國獼猴群B病毒分離鑒定和檢測方法研究初報 [J].實驗動物科學與管理,2000, 17:364.

[9] 韋毅,符明泰,石寨,等.三種不同抗原對猴B病毒刊檢測結果的比較研究[J].實驗動物科學與管理,2001,18:1-3.

[10] 饒軍華,劉曉明,田克恭,等.獼猴 SPF種群的建立及保持過程中B病毒抗體監測研究[J].中國比較醫學雜志,2003,13: 294-296.

[11] 盤寶進.用B病毒 EL ISA和人單純皰疹病毒 I型酶免疫法檢測食蟹猴血清中 B病毒相關抗體的研究[J].廣西畜牧獸醫,2005,21:10-12.

Comparison of TwoM ethod about Antibody aga inst Herpesvirus Sa im iri from RhesusMacaques

Q IAO Hong-wei,TONGWei,J IANG Hong,CONG Zhe,WANGWei,WEIQiang
(Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences and PekingUnionMedical College; ComparativeMedical Center,PekingUnionMedical College;KeyLaboratory of Human Disease ComparativeMedicine,Ministry of Health,Beijing 100021,China)

ObjectiveTo compare the serological detection sensitivity of sera againstHSV-1 andBV from humans and rhesusmonkeyswith PR(plaque reduction)and IFA(immunofluorescence assay)。MethodsThe PR assay described in this studywasmodified from the traditional viralplaque reduction assay by usingwith 1 mL ofDMEM medium containing 1% (weight/volume)ofmethylcellulose(4000 cP;Sigma,MC),and an improved crystal stainingmethod to achieve better plague for mation in HSV-1 infected Vero E6 cells.The neutralizing antibody titer was determined as the highest serumdilution which achieved 50%plaque reduction。ResultsIn this assay,HSV-1 infected Vero E6 cells for med clear plaques with the density of(115～116)dots/mL.The positive serum neutralizing antibodies titers and ratioswere 1∶80 and 100% both of HSV-1 and BV。Conclusions The PR assay described in this studywill be used not only for serological detection but also formedical selection in cellmodel.

Ceropithecine Herpesvirus type 1(BV);Herpes simplex virus type 1(HSV-1);Plaque reduction; I mmunofluoresence assay(IFA)

R373

B

1671-7856(2010)03-0057-04

2009-11-06

中央級公益性科研院所級本科研業務費,項目號:DWS200708;科技部基礎專項重點項目,項目號:2002DEA20023;科技部條件基礎平臺專項重點項目,項目號:2003D IA7J033。

喬紅偉,女,副研究員,研究方向:實驗動物病毒學。

魏強,教授,博士生導師,研究方向:實驗動物病毒學,疾病模型。E-mail:weiqiang0430@sohu.com