瘤胃微生物多樣性與分析技術的研究進展

中國農業科學院飼料研究所 符運勤 刁其玉 屠 焰＊

1 瘤胃微生物區系及其作用

反芻動物瘤胃內棲息著復雜、多樣、非致病的各種微生物，包括瘤胃原蟲、瘤胃細菌和厭氧真菌，還有少數噬菌體（馮仰廉，2004）。瘤胃微生物的種類極為多樣，每毫升瘤胃內容物中有不同種類細菌1010～1011個、原蟲105～106個、厭氧真菌（游離孢子數為103～105，包括6個屬）和噬菌體（顆粒數為 105～ 106個）（王夢芝等，2008）。 它們在反芻動物瘤胃發酵過程中起著關鍵作用，所以研究瘤胃微生物區系對提高反芻動物的飼養管理水平和生產性能有重要意義。

反芻動物出生時其消化道不存在厭氧細菌、厭氧真菌和原蟲，而后隨著與母體及環境的不斷接觸，瘤胃及其他消化道部位逐漸建立微生物區系。細菌是最早出現在瘤胃中的微生物，動物出生24 h后其瘤胃壁即有兼性厭氧細菌等存在，出生2 d后瘤胃內出現嚴格厭氧微生物。在成年前，反芻動物瘤胃內細菌菌群發生很大變化 （馮仰廉，2004）。經過適應和選擇，只有少數微生物能在消化道定植、存活和繁殖，并隨幼畜的生長和發育，形成特定的微生物區系（馮仰廉，2004）。瘤胃微生物間相互作用，維持瘤胃功能的穩定，瘤胃微生物區系保持動態平衡是保證瘤胃健康的前提。因此，對反芻動物生長過程中瘤胃微生物的發生、發展進行研究，了解瘤胃代謝和微生物之間的關系，并進行有益的調控，將促進反芻動物瘤胃健康發育，從而保障成年后的生產性能，也為合理應用飼料、開辟新的飼料資源提供理論依據。

2 瘤胃微生物區系的多樣性與分析技術

2.1 瘤胃微生物多樣性的研究 早期對瘤胃細菌的研究基于人工培養的方法，存在一定的局限性。當前人們對瘤胃中微生物的認識只有10%～20%，隨著科學技術的進步，現代分子技術也開始逐漸滲透到瘤胃微生物的研究中來，大大推動了瘤胃微生態領域的研究。近年發展起來的免培養結合16S rDNA的變性梯度凝膠電泳方法逐步克服了常規培養方法的不足（Muyzer，1999）。前人利用分子生物學技術的優勢分別對犢牛、成年奶牛和羊等進行了瘤胃微生物多樣性的研究。

2.1.1 犢牛瘤胃微生物多樣性 于萍等（2009）測定了60～120 d犢牛胃腸道纖維分解菌，認為脂解厭氧弧桿菌是犢牛斷奶后消化道中的優勢菌之一，不僅是十二指腸中唯一檢測到的菌群，而且在其他腸道中的數量也超過琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌等。在瘤胃、十二指腸、空腸和回腸等前段消化道中均未檢測到黃色瘤胃球菌，僅在后段腸道結腸和盲腸中檢測到該菌的存在。而龍淼等（2009）利用傳統培養法和分子生物學定量法對犢牛瘤胃干酪乳桿菌進行分離鑒定并對其相關耐酸基因進行克隆，為下一步研制瘤胃微生態制劑及構建瘤胃內耐酸的乳酸分解基因工程菌奠定了基礎。

2.1.2 成年奶牛和成年肉牛瘤胃微生物多樣性王遠亮等（2005）采用免培養技術對常規飼養條件下奶牛瘤胃微生物多樣性進行了初步分析，通過對瘤胃微生物16S rDNA序列的分析，初步構建了部分瘤胃微生物的系統發育樹，為更好地利用瘤胃微生物基因資源和奶牛營養研究提供了一些基本數據和材料。而鞏慶亮等（2008）采用PCR-16S rDNA鑒定和動態檢測奶牛瘤胃液細菌種類，共分離到56株，對其中7株具有代表性的細菌進行了PCR擴增，經序列同源性比較，最終把細菌鑒定為牛鏈球菌（A0625、A1212、0131）、蠟樣芽孢桿菌（0113）、地衣芽孢桿菌（0091）、短小芽孢桿菌（0083）和嗜熱鏈球菌（0123）。 裴彩霞等（2008）采用3對古菌特異性引物擴增瘤胃古菌16S rRNA基因分別建立克隆庫來研究晉南牛瘤胃古菌的多樣性，試驗結果提示瘤胃中存在大量的未知產甲烷菌。

2.1.3 不同品種羊瘤胃微生物多樣性 石鵬君等（2007）采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術對波爾山羊、內蒙古絨山羊、四川南江黃羊瘤胃細菌優勢菌群結構進行了比較分析，發現14條16S rDNA序列中有4條克隆的序列與基因庫最相似菌的相似性大于97%，其中13條與未鑒定菌或未培養菌的序列相似性最高，說明瘤胃中存在著豐富的未鑒定或不可培養細菌種類。從中可以發現3種山羊瘤胃細菌具有一定的相似性，種內個體間相似性明顯高于種間相似性，這說明寄主品種是影響瘤胃細菌種群構成的一個重要因素。

綜合反芻動物瘤胃微生物區系的研究來看，人們利用傳統與免培養技術對犢牛、成年奶牛、肉牛、羊瘤胃優勢菌群、瘤胃微生物多樣性和瘤胃中微生物的功能基因進行了部分研究并取得了一定進展，但對反芻動物瘤胃中菌群的建立，特別是隨月齡、日糧形態的動態變化規律上的報道很少。隨著對反芻動物瘤胃微生物研究的深入，對犢牛和后備牛瘤胃微生物區系的研究將顯得越來越重要，而現代分子生物學技術的發展和應用為此提供了技術上的保障。

2.2 瘤胃微生物區系分析技術 研究瘤胃微生物區系的方法一般分為瘤胃微生物傳統定量方法（滾管計數法和最大或然數法）和分子生物學定量方法（郭同軍等，2009）。

2.2.1 傳統定量方法 采用Hungate（1969）發展起來的厭氧培養技術，以及采用模擬瘤胃環境而設計的培養基，對瘤胃微生物進行分離、純培養、計數、形態鑒定、生理生化特性的鑒別、分類等。瘤胃細菌與真菌的數量用顯微鏡直接計數，常采用滾管法計數，以及最大或然數計數法（most probable number，MPN）。

2.2.1.1 亨蓋特厭氧滾管技術 亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特（Hungate）于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術。通過此培養技術可以研究瘤胃微生物的多樣性，楊舒黎（2007）采用滾管法研究了日糧中添加胡麻油和豆油對奶牛瘤胃纖維分解菌、蛋白分解菌、淀粉分解菌和總細菌數量變化。但此培養技術還存在局限性，因為大多數瘤胃微生物都是厭氧的，而保持絕對厭氧條件是一件很難辦到的事，非常不經濟，正因為如此，目前在實驗室能純培養出的瘤胃微生物是有限的，純培養技術還有待改進。

2.2.1.2 最大或然數（MPN）計數法 MPN法適用于測定微生物群落中不占優勢、但具有特殊生理功能的微生物類群的數量。 廣泛用于測定土壤、水體等環境中氨化、硝化、反硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化等特殊微生物生理類群和藻類的數量，以及牛奶等食品中的特殊微生物類群（如大腸桿菌）的數量；還可用于檢測環境中某些基因工程菌株的數量 （崔戰利等，2005）。Dehority等（1989）首次將MPN用于瘤胃細菌計數，結果發現該法與滾管法的總細菌數無差異；Theodorou等（1990）將改良的MPN用于瘤胃厭氧真菌的計數，研究結果表明，MPN法計數結果與滾管法相似，但與游動孢子直接記數的結果有很大差異。最大或然數對接種等試驗技能要求較低，液體培養基制備和接種所需時間較短，可直觀觀察生長情況，最終pH也易于檢測。此外，MPN法對液相和固相中的真菌均能可靠計數，對產生游動孢子少的厭氧真菌的計數更適用。MPN的缺點是不能對微生物進行分離研究。

2.2.2 分子生物學定量方法 隨著人們對瘤胃微生物原位生存狀態的研究，發現常規的分離培養方法很難全面地評估微生物群落多樣性。從瘤胃中簡單提取和厭氧培養計數，不能得到微生物在瘤胃生態系統中的生活特征和生態功能的信息。20世紀80年代以來，以小核糖體RNA16S rRNA為主的分子生物學技術的發展，用分子生物學方法研究瘤胃微生物生態克服了基于培養方法帶來的局限，加快了對瘤胃微生物群落的了解。

2.2.2.1 變性 （或溫度）梯度凝膠電泳 目前DGGE技術已經成為微生物群落遺傳多樣性和動態性分析的強有力工具，在微生物生態學領域中廣泛地應用于比較微生物群落的多樣性和監視種群動態（淡瑞芳等，2007）。DGGE技術對瘤胃細菌的研究主要集中于分析瘤胃細菌的多樣性、比較不同品種動物瘤胃細菌的多樣性和研究不同飼養條件對瘤胃細菌的影響 （謝林君等，2009）。DGGE技術優點是無需進行體外培養，直接利用微生物樣品中的DNA或RNA對微生物群體加以區別，可以很準確地判斷出它們之間的種屬關系，甚至還可能發現尚未分離鑒定的微生物。但不足之處是它只能檢測微生物區系中數量上的優勢種，在總DNA模板中某一種微生物的DNA含量小于1%時，難以用其檢測出來；另外，它只能對不同種的微生物DNA序列進行分離，而不能確定各DNA序列中突變的位置及相關信息，最終還得依賴于DNA測序分析（李啟琳等，2008）。

2.2.2.2 基于16S/18S rRNA的核苷酸 （基因）探針雜交技術定量瘤胃微生物 點雜交和狹線雜交技術是一種分子生物學的標準技術，最早出現于1979年，是將原始樣品中的總RNA或幾種核酸樣品分別定量固定在固相支持物 （尼龍膜或纖維素膜）上，然后用特異的探針與樣品雜交，通過估計樣品點信號強度，與已知濃度的標準品信號強度進行比較，確定待測樣品中靶序列的量；也可通過通用探針和特異探針在相同條件下分別對同一樣品進行雜交后的相應信號強度比來計算特異探針所對應的靶RNA占通用探針所對應的靶RNA的百分含量。王海榮等（2006）利用定量雜交法檢測綿羊瘤胃纖維細菌，試驗將提取的總RNA濃度系列稀釋后與通用細菌探針進行雜交，檢測結果所做的回歸分析表明，雜交信號與尼龍膜上的所點的量具有明顯線性關系。同時對幾份瘤胃樣品進行種纖維分解菌的初步定量檢測，結果顯示種纖維分解菌的相對豐度與前人報道相似，表明該方法能夠對瘤胃細菌進行定量分析，可在后續相關研究中使用。但分子雜交法結果重現性差，導致試驗結果不可靠。

2.2.2.3 其他分子生物學定量方法 隨著分子生物學的發展，還出現了一些其他的微生物多樣性的定量方法。主要有熒光原位雜交（FISH）技術、定量PCR和流式細胞計量術定量檢測等先進手段。分子生物學技術的應用，在許多方面改善了傳統的研究方法。應用鑒于16S rRNA的方法研究瘤胃細菌及真菌的多樣性，使得許多原來難以培養的菌株得以發現。

傳統的厭氧培養方法只能認識一小部分瘤胃微生物，大部分微生物不能培養，使得瘤胃微生物多樣性嚴重被低估，而且要求條件比較高，比如要求嚴格厭氧，費時費力。隨著分子生物學技術的發展，16S/18S rRNA/rDNA已經成功地用于瘤胃微生物生態研究中，通過 DGGE、雜交、FISH、競爭PCR和實時定量PCR來檢測微生物區系的變化，確定瘤胃微生物特別是細菌的數量。但這些分子技術也有其自身局限性，DGGE只能檢測微生物區系中數量上的優勢種，在總DNA模板中某一種微生物的所有DNA含量小于1%時，難以用其檢測出來；如果以1010個/mL瘤胃食糜計算，分子雜交方法最低檢測到總菌的0.01%，而競爭PCR可檢測到總菌的0.00001%。但目前由于可利用的寡核苷酸的探針數量很少，所以分子雜交獲得的信息是十分有限的。對于競爭性PCR，由于很難建造內標，因此應用性不強，而實時定量PCR比傳統PCR是一種很有希望的研究手段，在微生物的定量中有很光明的應用前景。分子生物學技術的優越性并不能完全取代傳統培養來研究瘤胃微生物，兩種方法應在研究瘤胃微生物多樣性中相輔相成。

2.3 益生菌對瘤胃發育的促進作用

2.3.1 瘤胃發育與微生物之間相互依賴 犢牛瘤胃的發育受多種因素影響，如犢牛日齡、飼料組成及形態、揮發性脂肪酸、瘤胃的pH值以及瘤胃微生物等，這些因素相互作用、相互牽制，共同影響瘤胃的形態發育。其中飼料組成及其物理形態是外因，瘤胃食糜pH值變化是內因，揮發性脂肪酸的組成比例不同是直接原因，而瘤胃微生物變化是根本原因（張海濤等，2008）。可見瘤胃微生物區系的建立和保持動態平衡是瘤胃發育之關鍵，因此為保障反芻動物瘤胃微生物健康，前人采用各種方法來調控瘤胃，其中包括控制原蟲數量來調控瘤胃發酵、通過基因工程改造瘤胃微生物和添加瘤胃調控劑。瘤胃調控劑用得較多的有微生物制劑、脲酶抑制劑、離子載體、礦物質元素、維生素以及醚類化合物鹵代物等。微生物制劑用得較多的是活性酵母添加物，枯草芽孢桿菌和一些復合菌制劑，這些微生物制劑以其無污染、無殘留和明顯的作用效果已引起了很多研究者的關注。

大量研究及生產實踐證明，益生菌能維持動物胃腸道菌群平衡，調節微生物區系；也有報道說在幼齡動物日糧中添加益生菌能夠影響動物消化道中的固有菌群種類及數量，進而提高動物的免疫力。對益生菌作用機制認識目前有：（1）加強黏膜屏障；（2）抗菌效應；（3）影響免疫系統；（4）抑制腸道疾病（許珂和魏萍，2009）。但由于目前的技術方法研究益生菌難度大，對這些機制還不是很清楚。

2.3.2 益生菌對瘤胃微生物的作用 研究證實，在動物飼料中添加益生菌可增強機體免疫功能，保持腸道微生態平衡、防治畜禽疾病，促進畜禽生長、擴大飼料來源、提高飼料轉化率，凈化環境、改善畜禽產品品質，并可減少或取代抗生素的用量。研究表明，在產奶牛飼料中投入地衣芽孢桿菌培養物能夠為奶牛提供比較好的瘤胃微生物生長因子，提高奶牛瘤胃細菌總數，降低其氨態氮濃度，提高瘤胃微生物對氨的利用，提高總揮發性脂肪酸產量和乙酸丙酸比例，降低瘤胃發酵的甲烷產量，在生產性能上則表現為提高產奶量和乳蛋白含量（喬國華和單安山，2008）。日糧中添加納豆芽孢桿菌，可促進斷奶后犢牛瘤胃及腸道中主要的纖維分解菌琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和脂解厭氧孤桿菌在消化道中的定植和生長；而飼喂產奶牛時具有提高產奶量、改善乳脂率、提高乳蛋白率、增加牛奶中干物質含量和降低牛奶中體細胞數的作用 （欒廣春等，2008）。其他益生菌方面，Chaucheyras-Durand等（2008）在對酵母菌及其培養物的研究中發現，活性干酵母對幼齡反芻動物瘤胃微生物的活性有積極作用，可以維持瘤胃pH穩定和防止瘤胃酸中毒，同時提高生長性能和瘤胃纖維分解菌的活性；酵母培養物可以改善荷斯坦犢牛胃腸道內環境，促進消化，提高犢牛對日糧粗蛋白質、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的全消化道消化率，因此可以提高平均日增重、改善體尺指標（閆曉剛等，2005）；米曲霉提取物和釀酒酵母發酵產物提高了水牛牛犢營養物質腸道表觀消化率，同時日增重也有所提高（Di Francia等，2008）；在綿羊上酵母添加物可減少瘤胃甲烷產生，延緩精料和干草飼糧下綿羊瘤胃能量的釋放（Mwenya等，2004）。而飼喂羔羊單一和復合活酵母培養物均可提高瘤胃微生物蛋白的合成，改善飼料轉化率，羔羊日增重分別提高了21%和 16%（Tripathi和Karim，2010）。

3 結束語

瘤胃微生物對瘤胃發育有很重要的作用，但目前在犢牛、青年牛瘤胃發育，尤其是微生物區系發生、發展上的研究尚不完善，因此，對于反芻動物瘤胃系統，從簡單到復雜，需要開展系統的犢牛-青年牛瘤胃微生物的發生發展研究。而近代分子生物學技術的發展，為研究瘤胃微生物提供了更為有效、簡便的方法，也為逐步打開“瘤胃黑箱”提供了可能。

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