中醫理論基礎研究中動物實驗若干問題的探討

王思成，楊龍會，鄒移海，郭學軍，徐春波，陳麗娜

(1.國家中醫藥管理局科技司，北京 100026;2.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405;3.世界中醫藥學會聯合會，北京 100048)

中醫藥是中華民族的傳統瑰寶，是人體生命科學的一個分支，是一門實踐性很強的學科。在古代科學條件下建立的中醫藥學，以“神農嘗百草”的方式識別、評價了眾多中草藥，并以“臨床試錯法”不斷總結中藥方劑的治病經驗，從而為中華民族及人類的健康事業作出了重大貢獻。實踐經驗的積累總結成為古代中醫發展的主要手段。要進一步闡釋中醫藥理論的科學內涵，還應借助現代科學的理論與方法，包括借助動物實驗手段，研究揭示中醫藥防病治病的機理和科學基礎。

1 動物實驗在中醫理論基礎研究中占有重要地位

實驗研究是實現中醫藥現代化的重要途徑，動物實驗作為生命醫學領域實驗研究的主要載體，其水平的高低將在一定程度上影響著中醫藥現代化的進程。在中醫藥研究中使用符合微生物控制標準的、合格的、遺傳背景清晰的高等級實驗動物，并在相應等級的動物實驗設施下完成實驗，是保證實驗結果準確可靠、真實反映所設計實驗目的和原理的基本條件，也是中國傳統醫學尋求新的發展、走向世界所必不可少的方法，其重要性及必要性不可忽視。動物用于實驗，源于古代人們對自然界動物自救治病本能的跟蹤觀察及人為對動物施加某種因素后的結果分析。動物實驗作為現代科學技術的支撐條件之一，必將在中醫藥現代化進程中發揮重要作用。為了支持中醫理論基礎研究的假說而設計的動物實驗，其實驗結果和數據應成為支持臨床有效和假說的有力證據，是提煉中醫理論的基本途徑之一。

從目前的現實情況看，實驗研究在中醫藥研究，特別是在基礎理論研究領域占有重要地位。作者對20個中醫藥期刊2008年發表的論文進行了統計，216期刊物共發表文章7708篇，涉及動物實驗的文章910篇占11.8%。其中《中藥藥理與臨床》的動物實驗文章占45%(72/159)，《針刺研究》37%(30/82)，《北京中醫藥大學學報》33%(76/232)，《中藥新藥與臨床藥理》24%(38/157)，《中國實驗方劑學雜志》22%(30/134)，《中國中西醫結合急救雜志》21%(35/164)，《廣州中醫藥大學學報》21%(25/120)，《南京中醫藥大學學報》18%(29/158)，《中華中醫藥雜志》17%(49/295)，《中國中藥雜志》14%(98/686)，《中國中醫基礎醫學雜志》14%(37/272)，《時珍國醫國藥》13%(153/1166)，《中藥材》12%(58/499)，《中國中西醫結合雜志》10%(35/354)，《中草藥》10%(62/634)，《中成藥》9%(60/650)，《中國天然藥物》7%(7/105)，《中國針灸》4%(15/346)，《中醫雜志》3%(18/641)，《新中醫》2%(20/854)。由此可見，動物實驗在中醫藥研究中所占的比例是比較高的。對中醫理論基礎研究中的動物實驗的基本要求進行規范，對于促進和提高中醫理論基礎研究的水平和質量具有重要意義。

我國自2005年在973計劃中設立中醫理論基礎研究專項以來，在重大中醫理論基礎研究方面大大加強了支持力度。從既往申報的項目看，涉及動物實驗的內容比較多，但對動物實驗和動物模型的描述多數卻并不具體。如有的申報項目中僅提及“制作老年性癡呆模型”，對造模使用實驗動物的品種品系、等級、體質量、性別、數量及動物實驗環境、模型制作的具體方法和評價指標，均無描述。

2 設計動物實驗應注意的幾個問題

隨著世界對動物福利重視程度的不斷增加，科學界對動物實驗提出了“3R”原則，提倡盡量減少動物實驗，結合中醫藥行業現狀，在國家重大中醫理論基礎研究中設計動物實驗必須注意幾個問題。

2.1 要正確認識動物實驗結果與人體的符合率

動物實驗結果不能完全符合人對處理因子(藥物、手術等)的反映。人類對藥物常常比所有動物都要敏感。不少藥物的毒性往往首先是在人體試用時才出現，而不是先出現于動物實驗中。更有一些嚴重的常見毒性反應是很難從動物實驗中預測的，如過敏反應、再生障礙性貧血、中毒性精神癥狀、特異質反應及動物無法顯示的毒性癥狀，如頭暈、頭痛、乏力、耳鳴、精神神經癥狀等。Zbinden 1966年統計86篇藥物評價報告涉及11115名患者，結果臨床上常見的45種不良反應中，至少有25種在動物實驗中不能確認。Litchfield在60年代統計了6類藥物(抗生素、合成抗菌藥、鎮靜藥、中樞抑制藥、抗氧化劑、皮質激素)在狗和大鼠中的毒性試驗，與人的相似性比較，在500名病人中共觀察到53種藥物反應癥狀，其中可由大鼠來預測的占34%，由狗預測的占55%，狗和大鼠2種動物也僅能預測57%。中醫“四診”觀察到的部分證候，同樣無法在實驗動物身上得到驗證。這就提醒人們，要客觀看待動物實驗和人體的符合率，不能期望從動物實驗中得到全面的信息來指導臨床使用[1]。

2.2 要具備開展動物實驗的基本條件

中醫藥實驗動物工作在近20年來雖然有了較大發展，但仍然處于薄弱地位，總體上尚不能適應中醫藥科研迅速發展的需要。根據對全國各省、市、自治區中醫藥單位的調查，擁有屏障環境動物實驗設施并取得地方動物實驗許可證的單位不足30家，動物實驗設施規模較大、技術力量較強的僅有數家中醫院校及研究院所。多數中醫藥單位在動物實驗設施、人員素質、儀器設備、科研水平、管理水平等方面相對落后，動物實驗設施尚停留在清潔級(該等級設施已被取消)、普通級的水平[2]。動物實驗設施條件的缺乏制約了這些單位開展動物實驗，因此對于必須設計動物實驗的項目，必須具備開展動物實驗的基本條件。

2.3 要遵循動物福利原則

實驗動物福利的實質是保障其不受虐待并得到合理的照料，要讓動物享有5大自由——不受饑餓的自由、生活舒適的自由、不受痛苦傷害和疾病威脅的自由、生活無恐懼和悲傷感的自由、表達天性的自由，以滿足實驗動物對維持生命、健康和舒適的需要。實驗動物福利和倫理是目前世界各國政府和民間普遍關注的重要問題，綠色和平組織則把保護動物福利提高到動物權利的高度。為此，美國、英國等大多數歐洲國家和日本等國都頒布了有關動物福利的條例及法規，以確保動物在實驗過程享有合理的福利。基于與國際接軌的需要，我國在2006年由國家科學技術部頒布了《關于善待實驗動物的指導性意見》。近年越來越多的人提倡在動物實驗中實行“3R”原則——替代、減少和優化原則。替代(replacement)原則要求盡可能采用低等實驗動物或非實驗動物，以替代高等實驗動物進行實驗。減少(reduction)原則要求盡可能減少實驗動物的用量。優化(refinement)原則要求優化實驗設計和操作，以減輕動物的痛苦[3～6]。

在這個前提下，盡量減少或不使用實驗動物已經成為實現動物福利原則的一種趨勢。在中醫理論基礎研究中，一方面必不可少的動物實驗必須遵循動物福利原則，另一方面一些沒有必要的動物實驗要盡量減少。

3 開展動物實驗的具體要求

中醫理論基礎研究中采用動物實驗可以進行各種因素的細微探討，而這是臨床研究難以做到的。在中醫理論基礎研究專項中開展的動物實驗，其實驗結果和數據應成為支持臨床有效和假說的有力證據，以達到詮釋中醫理論的目的。開展動物實驗的基本要求如下。

3.1 倫理學審查

在進行實驗研究前進行倫理審查是遵循動物福利原則的具體要求，也是在國外雜志發表相關論文的基本要求，故動物實驗設計應通過本單位實驗動物倫理委員會的審查。動物實驗倫理審查內容包括:動物實驗名稱和目的;使用的動物來源、品種品系、規格和數量，預計實驗開始和結束時間;實驗要點包括實驗方法、觀測指標、實驗結束后處死動物的方法等。研究者簽署自覺遵守實驗動物福利倫理原則，隨時接受實驗動物倫理委員會的監督與檢查，如違反規定，自愿接受處罰的保證。審查者對該項目是否必須用實驗動物進行實驗，即能否用計算機模擬、細胞培養等非生命方法替代動物或用低等動物替代高等動物進行實驗;申請人資格和所用動物的品種品系、質量等級、規格是否合適，能否通過改良設計方案或用高質量的動物來減少所用動物的數量;能否通過改進實驗方法、調整實驗觀測指標、改良處死動物的方法，來優化實驗方案、善待動物等項目進行審查并簽署意見。實驗動物中心(部)負責人(最好是獸醫)和單位動物福利委員會主任簽署意見。

3.2 實驗動物和動物實驗條件

國家科學技術部、衛生部、教育部、農業部、國家質量監督檢驗檢疫總局、國家中醫藥管理局和中國人民解放軍總后勤部衛生部于2001年頒布了《實驗動物許可證管理辦法(試行)》[7]，規定實驗動物生產供應單位必須取得實驗動物生產許可證，銷售實驗動物應該開具實驗動物質量合格證明;從事動物實驗的單位必須取得實驗動物使用許可證，動物實驗結束后應開具動物實驗設施使用證明。隨后各省區也制訂了相應的行政法規。開展動物實驗時，實驗動物必須從具備實驗動物生產許可證的單位購買，并索取實驗動物質量合格證明。項目申報材料應列出使用的實驗動物品種品系、等級、體質量、性別、數量。動物實驗應在具備實驗動物使用許可證的實驗室中進行，實驗結束后取得動物實驗設施使用證明。

實驗動物質量合格證明和動物實驗設施使用證明是申報科技成果必須提供的證據。國家《實驗動物管理條例》第十九條規定[8]:“應用實驗動物應當根據不同的實驗目的，選用相應的合格實驗動物。申報科研課題和鑒定科研成果，應當把應用合格實驗動物作為基本條件。應用不合格實驗動物取得的檢定或者安全評價結果無效，所生產的制品不得使用。”在成果評審中如果缺乏實驗動物許可證明，將會被一票否決。現實工作中發現，動物實驗多由研究生完成，導師沒有及時收集和保存上述證明而導致證明流失，由此影響了科技成果的申報。

3.3 動物實驗和動物模型

動物實驗和模型制作的申報材料應列出具體方法和評價指標。選擇的動物模型和動物實驗方法都必須是公認的，有文獻依據的。設計動物實驗前，應檢索所需動物實驗和模型制作方法，并經過預實驗加以證實其可行性。徐叔云的《藥理實驗方法學》、李儀奎的《中藥藥理實驗方法學》、陳奇的《中藥藥理研究方法學》、施新猷的《現代醫學實驗動物學》和中華人民共和國藥典委員會編撰的《中華人民共和國藥典(2005版)》等著作[9]，是動物實驗和動物模型制作的最佳參考書。前面提到的20個中醫藥期刊在2008年發表的910篇動物實驗論文中，涉及動物模型的文章有414篇(占45%)，其中論文數量排在前10位的動物模型有糖尿病(47篇)、肝損傷及肝纖維化(42篇)、動脈粥樣硬化及高脂血癥(26篇)、腦缺血(20篇)、關節炎(20篇)、老年性癡呆(13篇)、急性心肌缺血(12篇)、哮喘(12篇)、血瘀證(11篇)、肺癌(10篇)等，上述動物模型中最常用的造模方法值得借鑒。對新的動物實驗方法和動物模型要經過同行專家認可，否則方法學有問題，實驗結果的可靠性將受到質疑。

3.4 中醫證候動物模型

自20世紀60年代初腎陽虛證動物模型問世以來，中醫證候動物模型的研制經歷了40多年的發展，逐步形成了獨特的研究方法。如獨特的理論體系——“辨證論治”，獨特的評價標準——證、病、癥，獨特的處置措施——中藥、針灸、養生措施，獨特的觀察指標——舌、脈、汗、神、色，獨特的認識特色——審證求因等等。中醫證候動物模型的分類主要包括單純的中醫證候動物模型、病證結合的動物模型、狀態反應性動物模型、自然病態性動物模型或證候純系動物模型等。目前使用的中醫證候動物模型有五臟證候動物模型、六淫動物模型、七情動物模型、“八綱”動物模型、舌脈象動物模型、溫病動物模型、傷寒病證動物模型、針灸經絡的動物模型、痰證動物模型、胸脅苦滿動物模型、厥脫證動物模型等。

動物實驗如何才能貼切地詮釋中醫理論，是中醫藥研究面臨的重要課題。而其中由于證候是中醫學特有的概念，既是理論體系的主要內容之一，又是臨證的重要依據，所以中醫證候動物模型和病證結合動物模型(相當于具有中醫藥特色的人類疾病動物模型)的研究也就成為重中之重。但目前中醫證候動物模型的研究存在著中醫特色不強、病證模型研究進展緩慢、缺乏規范化等問題。尤其是后者嚴重制約了中醫證候動物模型的使用。例如在腎虛證的研究中，造模方法有20多類40多種方法，用藥劑量和造模時間也各不相同，使用的動物種類繁多(大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗等)，造模成功的評價標準也極不統一，由此制約了中醫證候動物模型的應用。有學者認為，中醫證候動物模型研究存在粗放性，模型制作普遍存在粗糙、不精致、重復率低、零碎而不成體系、不完美等現象。有鑒于此，考慮國家重大中醫基礎理論研究的要求，建議在中醫理論基礎研究中加強對中醫證候動物模型的研究，必須使用中醫證候動物模型時，對使用的中醫動物模型要有文獻依據并經過同行專家認可。

中醫藥的發展必須在充分依靠臨床實踐、全面傳承中國傳統醫學精髓的前提下，應用動物實驗等現代科技研究手段推動中醫藥的現代化。在國家中醫重大理論基礎研究中，只有通過動物倫理審查、具備相應的動物實驗條件、使用公認的動物實驗方法和動物模型，研究結果才會具有較高信度的證據并有可能得到行業內外的認可，從而為中醫理論的豐富和創新發展做出更大的貢獻。

[1]王治喬，袁伯俊.新藥臨床前安全性評價與實踐[M].北京:軍事醫學科學出版社，1997.11-13.

[2]楊龍會，鄒移海，王思成，等.中醫藥實驗動物工作的現狀、問題及對策[J].長春中醫學院學報，2005，21(5):1-3.

[3]賀爭鳴，李冠民.動物實驗替代方法概論[M].北京:學苑出版社，2003.

[4]王祿增，王捷，于海英主編.動物暨實驗動物福利學法規進展[M].沈陽:遼寧民族出版社，2004.

[5]陳筱俠，譯.美國動物福利法規匯編[M].上海:上海科學技術出版社，2006.

[6]國家科學技術部.關于善待實驗動物的指導性意見(國科發財字[2006]398號)，2006.

[7]國家科學技術部、衛生部、教育部、農業部、國家質量監督檢驗檢疫總局、國家中醫藥管理局、中國人民解放軍總后勤部衛生部.實驗動物許可證管理辦法(試行)(國科發財字[2001]545號)，2001.

[8]中華人民共和國國家科學技術委員會.實驗動物管理條例(1988年第2號令)，1988.

[9]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛生出版社，2002.