四君子湯對小鼠侵襲性肺曲霉病作用的實驗研究＊

羅閎丹，楊 芬，施 旻，謝小梅

(江西中醫學院現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌 330004)

侵襲性肺曲霉病(invasivepulmonary aspergillosis，IPA)是免疫力低下患者煙曲霉菌感染的最常見類型，其死亡率高達80% ～90%，預后很差。目前臨床上用于治療煙曲霉感染的藥物主要是化學合成類藥物，如兩性霉素B及其衍生物、唑類化合物、烯丙胺類等，它們對IPA的作用主要是通過直接抗煙曲霉菌而起效，這些藥物的毒副作用大、易產生耐藥性且價格昂貴，臨床應用受到限制，且單純的抗真菌藥物常難以奏效，因此調節、恢復或重建機體的免疫功能可能是根本措施。

研究表明，傳統的補益方劑如十全大補丸、四君子湯及當歸補血湯等，在治療深部真菌感染特別是白色念珠菌深部感染有一定的效果，但對煙曲霉深部感染的實驗治療研究較少。四君子湯作為傳統的補益方劑，能明顯改善機體免疫功能，臨床應用廣泛，迄今未見其對侵襲性肺煙曲霉病作用的實驗報道。本研究擬通過建立IPA小鼠模型，灌胃四君子湯，觀察其對IPA小鼠的影響，為中藥補益方劑用于治療難治性IPA積累實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

四君子湯購自江西省中醫院，按傳統組方配制:黨參9g，白術9g，茯苓9g，炙甘草6g。實驗前制成50%、100%、200%水煎劑備用。

實驗動物:清潔級昆明系小鼠，5周齡，體重為22g±2g，雄性，由江西中醫學院動物實驗中心提供。

酮康唑(TCZ)由西安揚森制藥有限公司生產，口服片劑(060421199);環磷酰胺(cy)由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產(06060521)。

煙曲霉菌:購于中國醫學真菌中心(南京)(為臨床分離菌株，編號為3910);蔡氏培養基:參考文獻制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將小鼠隨機分為7組:A組(n=5):正常組(正常健康小鼠);B組(n=5):免疫抑制組(僅注射環磷酰胺小鼠);C組(n=15):正常+接種煙曲霉組(不注射環磷酰胺但接種煙曲霉小鼠);D組(n=15):模型組(免疫抑制并感染煙曲霉菌小鼠);E組(n=15):低劑量四君子湯治療組(給予50%四君子湯灌胃的IPA小鼠);F組(n=15):中劑量四君子湯治療組 (給予100%四君子湯灌胃的IPA小鼠);G組(n=15):高劑量四君子湯治療組(給予200%四君子湯灌胃IPA小鼠);H組(n=15):陽性對照組(給予酮康唑灌胃的IPA小鼠)。

1.2.2 小鼠IPA模型建立

誘導免疫抑制:各組小鼠腹腔注射cy200mg·kg·d，A、C組腹腔注射相同劑量生理鹽水，連續注射2d，測定小鼠淋巴細胞百分率、巨噬細胞數、脾細胞數及胸腺和脾臟的重量。

建立IPA小鼠模型:將煙曲霉菌活化2次后收集菌液，煙曲霉孢子懸液制備成孢子濃度為107個/ml。乙醚麻醉小鼠，加樣槍吸取孢子懸液50μl滴入鼻孔，使之被動吸入肺部。

1.2.3 給藥方法 四君子湯治療組從煙曲霉菌吸入當天開始給藥，每日灌胃1次，每日O.5ml，連續給藥1周。另設酮康唑陽性對照組:酮康唑(TCZ)按小鼠體表面積折算其用量，劑量為30mg·kg·d，其余各組灌胃同等劑量生理鹽水。

1.2.4 小鼠各臟器煙曲霉培養 各組小鼠灌胃7d后，于第8天處死，無菌取肺、肝、脾、腎組織碾磨，在蔡氏固體培養基上培養4d～6d，計數菌落數。

1.2.5 各臟器的病理切片觀察 于第8天無菌取小鼠肺、肝、脾、腎用福爾馬林固定做石蠟切片，分別用HE和PAS常規染色。鏡下觀察各組織的病理改變情況。

1.2.6 生存保護實驗 另取清潔級昆明系小鼠90只，隨機分成6組，即正常組+煙曲霉接種組、模型組、低劑量四君子湯治療組、中劑量四君子湯治療組、高劑量四君子湯治療組和陽性對照組。從接種煙曲霉開始連續4周觀察小鼠生存情況。

1.3 數據統計分析

所有數據用SPSS統計分析軟件處理，t檢驗法進行組間差異顯著性分析。

2 結果

2.1 環磷酰胺誘導的免疫抑制

表1顯示，小鼠腹腔連續2d注射環磷酰胺200mg·kg·d，與正常組小鼠比較，脾臟和胸腺重量下降，脾細胞數、腹腔巨噬細胞數及外周血淋巴細胞百分比顯著降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，說明小鼠連續2d腹腔注射環磷酰胺200mg·kg·d能有效誘導免疫抑制。

2.2 小鼠各組織煙曲霉培養情況

表2、圖1～圖5顯示，正常組+煙曲霉菌接種組與IPA模型組的肺、肝組織菌落數差異有顯著性意義(P<0.05);各治療組與IPA模型組的肺、肝組織菌落數差異有顯著性意義(P<0.05)，且煙曲霉色素明顯減弱;四君子湯低劑量組分別與中、高劑量組及陽性對照組比較，肺、肝組織的煙曲霉菌落數差異有顯著性意義(P<0.05);中、高劑量組分別與陽性對照組比較，肺、肝組織的煙曲霉菌落數差異無顯著性意義(P>0.05);脾、腎組織煙曲霉培養的菌落數都較少，各組之間差異無顯著性意義。

表1 環磷酰胺給藥組與正常對照組免疫指標的比較(±s，n=5)

表1 環磷酰胺給藥組與正常對照組免疫指標的比較(±s，n=5)

注:與正常組比較:★P<0.05

組 別 劑量(mg·kg －1·d －1)時間(d)脾臟重量(g)胸腺重量(g)淋巴細胞百分比(%)脾細胞數(106)腹腔巨噬細胞數(106)正 常 組 0 2 0.1044±0.0431 0.0484±0.0211 81.74±7.63354.83±7.144 7.221±1.544 CY 組 200 2 0.0378±0.0674★ 0.0173±0.0073★ 37.54±6.674★ 5.883±0.996★ 0.754±0.3852★

表2 各組小鼠肺、肝、脾、腎組織煙曲霉菌落數比較(±s)(單位:個/ml)

表2 各組小鼠肺、肝、脾、腎組織煙曲霉菌落數比較(±s)(單位:個/ml)

注:與IPA模型組比較:★P<0.05，☆P>0.05;與四君子湯低劑量組比較:▼P<0.05，▽P>0.05;與陽性對照組比較:◇P>0.05

組別劑量 菌落數肺肝脾腎正常+煙曲霉菌接種組 —IPA模型組 —50%水煎劑 0.5ml/d四君子湯治療組 100%水煎劑 0.5ml/d 200%水煎劑 0.5ml/d陽性對照組(酮康唑)9.0± 0.41★ 3.0±0.55★ 5.0±0.55☆ 6.5±0.80☆30mg/kg/d 102.0±14.06 56.0±8.64 13.0±1.51 9.0±1.12 47.0± 3.91★ 21.0±2.49★ 6.5±0.83☆ 8.0±0.54☆16.0± 2.58★▼◇ 10.0±1.47★▼◇ 10.5±1.16☆▼◇ 6.5±0.80☆▼◇20.5± 2.60★▼◇ 12.0±1.88★▼◇ 8.0±1.51☆▼◇ 4.5±0.69☆▼◇24.5± 2.42★▼ 17.0±1.34★▼ 9.0±0.69☆▼ 9.0±1.24☆▼

2.3 各臟器的組織病理變化情況

圖6～圖9顯示，鏡下見IPA模型組的肺組織有大量菌絲團，伴有壞死及大量炎細胞浸潤，并可見部分氣管上皮細胞壞死脫落;肝組織內見肝竇擴張，肝細胞水腫，部分細胞脂肪變性;腎組織血管充血，部分腎小球囊腔消失。低濃度四君子湯組肺組織見少量菌絲，間質明顯增生，氣管周圍淋巴細胞浸潤明顯，有小灶性出血;肝細胞水腫明顯，肝內可見多處灶狀炎細胞浸潤，并有巨噬細胞增生，腎臟未見明顯病變。中濃度和高濃度四君子湯組肺組織未見菌絲，肝細胞輕度水腫脂肪變性，腎臟除有輕度充血外基本正常。

圖1 ～圖5 各組肺組織煙曲霉培養情況

圖6 ～圖9 各組肺組織病理變化

2.4 小鼠生存實驗

表3顯示，低劑量、中劑量、高劑量組和陽性對照組小鼠的存活率均高于IPA模型組，其中中劑量組小鼠的存活率和生存質量明顯高于IPA模型組，且高于低劑量、高劑量和陽性對照組。

表3 各組小鼠生存率比較

3 討論

侵襲性肺曲霉病常發生于有明顯免疫缺陷的患者中，特別在器官移植、中性粒細胞缺乏、接受免疫抑制劑、皮質類固醇治療的患者中尤為常見，正常人群不易感染煙曲霉。中醫理論認為，“正氣存內，邪不可干”。所謂正氣，一般指正常的免疫功能，正氣虛則免疫功能低。正氣強弱是疾病發生與否的根本原因，并在疾病的發展變化及轉歸中起主導作用［5］。當機體正氣不足時，通過扶正以提高和調節機體的免疫功能，達到排除和抑制病邪的目的。

本實驗發現，正常小鼠接種煙曲霉組4周后的存活率為100%，IPA模型組4周后的存活率僅為26.7%，中劑量四君子湯治療組4周后的存活率為60%，提示提高機體的免疫力對預防和治療侵襲性肺曲霉病有極其重要的意義。

四君子湯原出于宋·《太平惠民和劑局方》，方藥組成有黨參、炙甘草、茯苓、白術4味藥物。根據“脾居中州”、“脾虛易生濕”、“濕重易傷脾”的中醫理論組方遺藥，用補益中氣的藥物治療脾虛，佐以祛濕之品以助健脾之功，諸藥合用，共奏健脾益氣之功。中醫理論認為，脾為后天之本，“脾旺不受邪”，四君子湯對特異性和非特異性免疫功能的增強作用是其補脾益氣功效的藥理基礎。

本實驗通過給予IPA模型小鼠低、中、高不同劑量的四君子湯，發現其肺組織的病理結果均有不同程度的改善，其中以中劑量組最佳;各組織的煙曲霉培養結果也顯示，給予四君子湯組的菌落數明顯少于IPA模型組且煙曲霉的色素明顯減弱;同時生存實驗還發現，中劑量四君子湯治療組能明顯提高IPA模型小鼠的生存時間，改善生存質量。提示四君子湯對IPA模型小鼠有一定的治療作用，其作用機制研究是我們下一步要做的工作，特別是從免疫學方面通過細胞和分子生物學技術做更深入的研究探討，為中藥補益方劑治療難治性IPA奠定了一定的理論基礎。