人乳腺癌干細胞異種移植動物模型的制備和應用

許煒茹，林洪生，陳信義，張英

(1.中國中醫科學院 廣安門醫院腫瘤科，北京 100053;2.北京中醫藥大學，北京 100029)

人乳腺癌干細胞異種移植動物模型的制備和應用

許煒茹1，2，林洪生1，陳信義2，張英1

(1.中國中醫科學院 廣安門醫院腫瘤科，北京 100053;2.北京中醫藥大學，北京 100029)

越來越多的證據顯示乳腺癌干細胞是導致乳腺癌發生、發展、復發和轉移的根源。因此，模擬出與人乳腺癌發病機制相似的動物模型將對乳腺癌的治療起著至關重要的作用。本文旨在介紹乳腺癌干細胞異種移植動物模型的制備方法、應用以及近年來的研究進展。

乳腺癌;干細胞;動物

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈迅速上升趨勢，在女性各類腫瘤中居首位［1］。乳腺癌的預防、診斷和治療已經成為腫瘤研究的熱點。近些年，隨著干細胞理論研究的不斷深入，越來越多的證據表明腫瘤中存在一小群腫瘤干細胞(cancer stem cell)，它們具有自我更新及形成腫瘤的各種不同譜系細胞的能力，它們是導致腫瘤產生以及腫瘤復發和轉移的根源。因此，如何能針對腫瘤干細胞而研制出有效的藥物才能從根本上戰勝癌癥。目前建立了乳腺癌干細胞異種移植的動物模型，但是這種模型還處于初級階段，有些腫瘤干細胞的成瘤率還不盡人意，并且近些年的研究也僅局限于乳腺原位接種成瘤。因此，如何能模擬出與人乳腺癌發病機制相似的動物模型是亟待解決的問題，以便提供有價值的動物模型來尋求更好的治療策略。

1 實驗動物的選擇

人乳腺癌細胞異種移植要求都是免疫缺陷的動物模型，故人體腫瘤異種移植時無排斥反應，移植后的人體腫瘤保持其原有的組織形態，免疫學特點以及特有的染色體組型和對抗腫瘤藥的原有敏感性。常選用的動物主要有重癥聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖型糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠、裸鼠。

Bosma等［2］首次在 C.B-17Icr小鼠中發現單個隱性突變基因(scid基因)，純合 scid基因導致 T、B淋巴細胞不能分化為特異性功能淋巴細胞，此突變型小鼠即SCID小鼠。該品系小鼠T、B淋巴細胞功能缺陷，NK細胞及巨噬細胞功能正常。此外，文獻報道2%～23%的SCID小鼠出現淋巴細胞免疫功能恢復(滲漏現象)［3］，故該品系的小鼠仍可對移植物產生一定的免疫排斥反應［4］，因此影響了 SCID小鼠的更廣泛應用。

Jackson實驗室將非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與SCID小鼠雜交后獲得 NOD/SCID小鼠［5］。該品系小鼠保留了 SCID小鼠 T、B淋巴細胞缺陷的特點，同時還具有 NK細胞活性低、抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)功能缺陷的特征。此外，NOD/SCID小鼠滲漏現象少。鑒于 NOD/SCID小鼠具有多種先天和獲得性免疫缺陷，不易發生免疫逃逸，其異種移植成功率較SCID小鼠明顯提高。并且裸鼠體內雌激素(E2)、孕激素水平均較NOD/SCID小鼠低［6］，對于乳腺癌這種激素依賴性的腫瘤來說，高激素水平的NOD/SCID小鼠更適合其腫瘤細胞的生長。因此NOD/SCID小鼠在人乳腺癌干細胞成瘤模型中最為常用。但是，NOD/SCID小鼠胸腺淋巴瘤的發生率較高，在SPF條件下平均壽命僅有8.5個月［7］，生存時間較 SCID鼠短，這限制了移植瘤的長期研究。

裸鼠即純合子nu/nu基因突變小鼠，全身形似無毛，呈裸體狀，無胸腺，T淋巴細胞功能缺陷，對體外移植物的免疫排斥反應較低［8］。但其免疫缺陷程度沒有SCID和NOD/SCID小鼠重，故在腫瘤干細胞異種移植的成瘤動物模型中沒有前兩者常用。但是異種移植接種的部位都是在乳腺原位，而裸鼠無毛易于接種;人乳腺癌干細胞異種移植接種的細胞數量級很低，成瘤時間較長，裸鼠無毛的特點也易于動態觀察腫瘤的生長狀態;并且裸鼠較SCID和NOD/SCID小鼠價格便宜。

總的來說，這三種小鼠用于異種移植成瘤模型各有利弊，還需要根據實驗的具體要求選擇合適的小鼠。

2 原位乳腺癌干細胞異種移植常用的制備方法

2.1 異種移植前小鼠的準備

2.1.1 人源化小鼠的乳腺:在移植乳腺癌干細胞之前使移植的小鼠乳腺人源化能利于人乳腺癌細胞的生長［9］。小鼠乳腺在青春前期被清除，并且注射一種被放射過的和未被放射過的人成纖維細胞混合物。放射過的人成纖維細胞(4Gy)能分泌各種生長因子、膠原，因此能支持正常細胞和癌上皮細胞的生長［10-11］。此種動物模型的建立曾被 Kuperwasser等［12］用于正常乳腺上皮細胞的移植。永生的成纖維細胞是將原代的人乳腺成纖維細胞轉染逆轉錄病毒而表達端粒末端轉移酶。乳腺癌干細胞在人源化的乳腺建立2～4周后再移植至小鼠的乳腺內。

2.1.2 降低小鼠的免疫力:極低數量級的人乳腺癌干細胞移植到小鼠體內仍然能存活，而并沒有因為小鼠自身的免疫力而被清除。Al-Hajj等［13］利用化療藥物依托泊苷腹腔注射入移植前的小鼠體內，使NOD/SCID小鼠的免疫力進一步下降從而有利于干細胞的生長。

2.1.3 提高小鼠體內的E2水平:E2受體陽性的人乳腺癌細胞異種移植后需要給小鼠補充一定量的E2，常用60 d緩釋的 0.72 mg的 17β-E2片，或每隔10 d，每只小鼠皮下注射0.4 mg/kg E［14］2，使小鼠血清E2保持在一定的水平。但是，E2促進腫瘤生長的同時，也帶來了副作用。其中腎損傷和膀胱結石是導致小鼠死亡的主要原因。因此，E2如何能促使乳腺癌細胞生長的同時還能盡可能減少對小鼠的損傷是急需解決的難題。Kang等［15］報道90 d緩釋的0.18 mg低劑量的17β-E2緩釋片不僅能促進乳腺腫瘤的生長，并且埋這種緩釋片小鼠的死亡率顯著下降。故在今后的乳腺癌干細胞異種移植成瘤實驗中可以嘗試應用。此外，除了E2受體陰性的人乳腺癌細胞異種移植后的生長和轉移也依賴于 E2。研究發現藥理學濃度的17β-E2可以抑制裸鼠的 NK細胞活性，給移植E2受體陰性腫瘤的裸鼠一定量的E2可以促進腫瘤的轉移［8］。因此，無論是 E2受體陰性或是陽性的人乳腺癌干細胞異種移植時均可給予E2以提高成瘤率。

2.2 細胞的制備—基質膠

乳腺癌干細胞異種移植時通常將干細胞懸液混合一定的基質膠以提高成瘤率，混合的比例通常為1∶1。基質膠是由層粘連蛋白、IV型膠原纖維、硫酸乙酰肝素和巢蛋白組成的混合物，在4℃為液體，而在37℃則聚合形成一種凝膠［16-17］。基質膠混合物增加異種移植瘤的成活率可能是因為它能形成一個有效的屏障，使腫瘤細胞免于局部免疫效應細胞的攻擊。此外，基質膠也提供一個自然的結構或立體空間，使瘤細胞接近一些粘附分子或促有絲分裂分子，如層粘連蛋白、纖維連接蛋白和 IV型膠原纖維［8］。

3 異種移植的動物模型

3.1 原位成瘤動物模型

目前，乳腺癌干細胞異種移植的動物模型分為原代移植和細胞系移植。2003年 AL-Hajj等［13］首次分離出了實體腫瘤干細胞，他們從乳腺癌患者的惡性胸腔積液分離出一類表型為 CD44+CD24－/lowESA+的癌細胞，僅約200個細胞即可在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤，成瘤率為100%。乳腺癌細胞系也廣泛應用于異種移植的動物模型中，如常用的乳腺細胞系MCF-7，MDA-MB-231。但是，有些細胞系中尚未被發現乳腺癌干細胞。

乳腺癌干細胞異種移植常接種于小鼠的乳脂墊(mammary fat pad)［9，13-14，18］。如 Al-Hajj 等［13］成 功將CD44+CD24－/lowESA+乳腺癌干細胞接種于NOD/SCID小鼠的乳脂墊內并形成腫瘤。Price等［19］曾對比皮下接種和乳脂墊接種的差異。該研究利用細胞株 MDA-MB-231和 MDA-MB-435分別進行皮下注射接種和乳脂墊接種。結果發現乳脂墊接種后的成瘤率為100%，而皮下途徑為40%，并且乳脂墊接種后轉移率也提高。因此，這種原位移植不僅可以提高乳腺癌細胞的成瘤率而且可以增加轉移的發生率。

3.2 乳腺癌轉移動物模型

Croker等［20］通過鼠尾靜脈分別注射人乳腺癌細胞系的干細胞 ALDHhiCD44+CD24－，發現注射MDA-MB-231、MDA-MB-468細胞系的NOD/SCID小鼠分別在5～7周和12周后會出現肺和其他器官的轉移灶。目前，乳腺癌干細胞的標志物還在繼續摸索之中，所以研究的熱點主要集中在原位異種移植，而乳腺癌干細胞轉移動物模型的建立還非常少。Croker等建立的乳腺癌轉移的動物模型，為乳腺癌干細胞轉移動物模型的建立奠定了良好的基礎，今后的研究應從乳腺癌細胞系的干細胞逐漸向原代乳腺癌干細胞轉移，從而真正建立乳腺癌干細胞轉移的動物模型。

4 結語

同大多數實體瘤一樣，乳腺癌患者死亡的主要原因是轉移和復發，轉移是腫瘤細胞最難復制的特性［21］。而腫瘤干細胞目前被認為是腫瘤復發和轉移的根源，因此如何能利用腫瘤干細胞的這種特點模擬出腫瘤復發和轉移是當前亟待解決的難題。本文介紹了近年來乳腺癌干細胞異種移植動物模型的建立，但是目前研究水平有限，有些低數量級的乳腺癌干細胞的成瘤率還較低，不足以模擬出人體內的乳腺癌復發和轉移。這種低成瘤率也限制了對乳腺癌干細胞在動物體內的藥物學研究。并且目前的研究還僅限于乳腺原位的異種移植，極少涉及乳腺癌干細胞轉移模型的建立。因此，今后的研究可以進一步探索乳腺癌轉移模型的建立。

［1］ Kellen E，Vansant G，Christiaens MR，et al.Lifestyle changes and breast cancer prognosis:a review［J］.Breast Cancer Res Treat，2009，114(1):13－22.

［2］ Bosma GC， CusterRP， Bosma MJ. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse［J］.Nature，1983，301(5900):527－530.

［3］ Dorshkind K，Keller GM，Phillips RA，et al.Functional status of cells from lymphoid and myeloid tissues in mice with severe combined immunodeficiency disease［J］.J Immunol，1984，132(4):1804－1808.

［4］ Dorshkind K，Pollack SB，Bosma MJ，et al.Natural killer(NK) cells are presentin mice with severe combined immunodeficiency(Scid)［J］.J Immunol，1985，134(6):3798－3801.

［5］ Prochazka M，Gaskins HR，Shultz LD.The nonobese diabetic SCID mouse:model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1992，89(8):3290－3294.

［6］ Kopf－Maier P，Mboneko VF.Anomalies in the hormonal status of athymic nude mice［J］.J Cancer Res Clin Oncol，1990，116(3):229－231.

［7］ Camacho RE，Wnek R，Fischer P，et al.Characterization of the NOD/scid-［Tg］DR1 mouse expressing HLA-DRB1*01 transgene:a model of SCID-hu mouse for vaccine development［J］.Exp Hematol，2007，35(8):1219－1230.

［8］ Clarke R.Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer.The immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines［J］. Breast Cancer Res Treat，1996，39(1):69－86.

［9］ Ginestier C，Hur MH，Charafe-Jauffret E，et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome［J］.Cell Stem Cell，2007，1(5):485－487.

［10］ Orimo A，Gupta PB，Sgroi DC，et al.Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion［J］.Cell，2005，121(3):335－348.

［11］ Tlsty TD，Hein PW.Know thy neighbor:stromal cells cancontribute oncogenic signals［J］.Curr Opin Genet Dev，2001，11(12):54－59.

［12］ Kuperwasser C，Chavarria T，Wu M，et al.Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(14):4966－4971.

［13］ Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci，2003，100(7):3983－ 3988.

［14］ Ponti D，Costa A，Zaffaroni N，et al.Isolation and in vitro propagation oftumorigenic breastcancer cells with stem/progenitor cell properties［J］.Cancer Res，2005，65(13):5506－5511.

［15］ Kang JS， Kang MR， HanSB， etal.Low doseestrogen supplementation reduces mortality of mice in estrogen-dependent human tumor xenograft model［J］.Biol Pharm Bull，2009，32(1):150－152.

［16］ Mehta RR，Graves JM，Hart GD，et al.Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice［J］.Breast Cancer Res Treat，1993，25(1):65－71.

［17］ Friman R，Kibbey MC，Royce LS，et al.Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel［J］.J Natl Cancer Inst，1991，83(11):769－774.

［18］ Charafe-Jauffret E，Ginestier C，Iovino F，et al.Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature［J］.Cancer Res，2009，69(4):1302－1313.

［19］ Price JE，Polyzos A，Zhang RD，et al.Tumorigenicity and metastasis of human breast carcinoma cell lines in nude mice［J］.Cancer Res，1990，50(3):717－721.

［20］ CrokerAK， Goodale D， Chu J， etal. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability［J］.J Cell Mol Med，2008，13(8):2236－2252.

［21］ Price JE.Metastasis from human breast cancer cell lines［J］.Breast Cancer Res Treat，1996，39(1):93－102.

Establishment and Application of Animal Models of Xenotransplantation of Human Breast Cancer Stem Cells

XU Wei-ru1，2，LIN Hong-sheng1，CHEN Xin-yi2，ZHANG ying1
(1.Oncology Department，Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China;2.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Accumulating evidence shows that breast cancer stem cells are the origin of carcinogenesis，tumor progression，relapse and metastasis.Therefore animal models simulating similar pathogenesis of human breast cancer will play an important role in the research on treatment of breast cancer.This review aims to introduce the method，application and progress of in research on animal models of human breast cancer stem cells.

Breast cancer;Stem cell;Animal

R737.9，332

A

1005-4847(2010)05-0429-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2010.05.16

2010-03-08

國家自然科學基金(編號:30772867)。

許煒茹(1983－)，女，北京中醫藥大學，2008級博士研究生。

林洪生(1949－)，女，主任醫師，博士生導師。Tel:010-88001192，E-mail:drlinhongsheng@163.com