Klotho基因及其多態性的研究進展

孟慶玲 黃 曙 范志寧

(南京浦口醫院消化內科,江蘇 南京 210031)

Klotho基因是 Kuro等〔1〕于 1997年發現的與衰老有關的新基因,并用古希臘神話中紡織生命之線女神的名字命名。Klotho基因被敲除的小鼠(KL-/-小鼠)可出現類似人類衰老的各種表型,如壽命縮短、不育癥、動脈硬化、皮膚萎縮、骨質疏松、肺氣腫等。近年來對klotho基因多態性與疾病的關系逐漸受到重視,現將有關研究現狀綜述如下。

1 Klotho基因的結構

Klotho基因長 50 kb,由 5個外顯子和 4個內含子組成〔2,3〕。人的 klotho基因位于 13q12,klotho基因的操縱子內沒有 TATA盒和 CAAT盒,但有 5個潛在的 SP1結合位點,外顯子1及旁側 2 000 bp序列中,G+C的平均含量為 66.75%,最高達到 98%,提示在這一區域有 CpG島的存在〔1,4〕。在 klotho基因結構中,其RNA存在著一個潛在的可變剪切位點,這一位點如果接受了一個 50bp片段的插入,該插入序列末尾的兩個核苷酸TA就會與外顯子 4的第一個核苷酸G共同構成一個終止密碼 TAG,使得RNA由此截斷形成一個短的開放閱讀框,僅含3個外顯子和 2個內含子而編碼分泌型klotho蛋白。但如果可變剪切位點沒有 50bp片段的插入,其RNA就是一個完整的結構,包括 5個外顯子和 4個內含子,編碼形成一種膜型 klotho蛋白。人的膜型 klotho cDNA全長 3 036 bp,分泌型 cDNA全長1 647 bp。膜型klotho基因表達的膜型蛋白是一種單跨膜蛋白,包括一個N端信號序列、帶有兩個內部重復片段的KL1和KL2細胞外區域,一個單跨膜區和一個短的胞內區。在KL1和KL2之間有一段 Lys-Lys-Arg-Lys的堿性氨基酸序列,可能為蛋白酶裂解位點,該位點有時可能被裂解,釋放出小肽而作為體液因子發揮作用。而分泌型 klotho基因表達的分泌型蛋白由于可變剪切的原因,僅含有 N端序列和 KL1胞外區,缺少了KL2胞外區、跨膜區和胞內區。人的膜型蛋白含有 1 012個氨基酸,分泌型蛋白含有 549個氨基酸。

2 Klotho基因多態性

Klotho基因共含有 400多個單核苷酸多態性(SNPs),其中影響轉錄和蛋白表達的主要是啟動子區和外顯子區的 SNPs,其中啟動子區有 16個 SNPs,5個外顯子區共有 15個 SNPs,其余均在內含子內。目前研究最多的是 KL-VS〔5〕,包含 6個SNPs,位于外顯子 2區附近,3個 SNPs在外顯子 2區內,其中 1個為無義突變,另兩個 F352V(A1056G)和 C370S(G1110C),這 6個SNPs處于完全連鎖不平衡。KL-VS具有明顯的種族特異性,白種人群有 20% ～31%的變異〔5,6〕,而日本和韓國等亞洲人群未發現變異〔7,8〕。其他如啟動子-395也存在 G-A變異,在正常人群中 G、A的頻率分別為 80.4% ～85.7%和 14.3% ～19.6%〔7,9,10〕。 該等位基因是 Kawano等〔8〕在研究絕經后婦女骨密度時發現,電泳遷移率變動分析(EMSA)顯示 G→A替換后 DNA蛋白復合物的量明顯下降,推測該替換可能通過減少蛋白和klotho基因啟動子區結合而改變klotho基因表達。外顯子 4區的 C1818T(His→His)的變異,并不能引起氨基酸表達的改變,但可能也與某些疾病有關,多項研究表明〔11,12〕外顯子區的無義突變也可能產生有異常功能的多種轉錄或影響產物的表達水平,Kawano等〔8〕用 RT-PCR方法沒有發現 C1818T變異引起的 klotho基因轉錄的變化,推測C1818T位點可能與影響klotho基因功能的一個 SNP位點有機聯系在一起。在正常人群中 C、T的頻率分別為 58.9% ～81.9%和 18.1% ～41.1%〔7,10〕。 klotho基因其他 SNPs如啟動子區 G-959C、外顯子 1區 A44C和 C234G、外顯子 4區 C2298T等,因未發現與疾病有關或小等位基因頻率低于5%,在此不再贅述。

3 Klotho基因多態性與疾病易感性的關系

3.1 Klotho基因與心血管疾病 Klotho基因缺陷的小鼠在出生 4 w后即可出現動脈硬化,并隨著年齡的增加而加重,這些血管變化與人類動脈硬化非常相似。把外源性正常klotho cDNA轉導給 klotho基因缺陷的小鼠后,其動脈硬化程度可得到顯著改善〔1〕,由此推測在人體也可能存在 klotho基因突變或有特定的 klotho等位基因與動脈硬化密切相關。為此,Arking等〔13〕檢測了兩組相互獨立的無癥狀冠心病患者的KL-VS等位基因頻率,同時比較冠心病的危險因素如血糖、血脂、血壓、體重指數、吸煙情況,經過 Logistic回歸分析,證實 KL-VS等位基因是早發冠心病的獨立危險因素。隨后他們〔14〕又檢測了 525例北歐猶太教徒的 KL-VS等位基因頻率,并用多元回歸法分析KL-VS基因型與血壓、血脂等心血管危險因素的關系,發現HDL-C和收縮壓與 KL-VS具有相關性,野生型(FF)和 KL-VS純合型(VV)與雜合型(FV)相比,HDL-C分別下降了 3.47和9.80mg/dl,收縮壓升高 6.51和 18.97mmHg,提示 KL-VS純合型患心血管疾病的危險度最高。用 Cox回歸分析,KL-VS純合型和野生型較雜合型相對危險度提高了 4.49和 2.15倍。以上報道均提示 KL-VS基因與心血管疾病密切相關。除 KL-VS基因外,在亞洲地區也進行了啟動子區G-395A與心血管疾病關系的研究其關系目前尚不明確。Imamura等〔9〕認為冠狀動脈狹窄患者 klotho基因-395A等位基因頻率(29.9%)明顯高于對照組(19%),調整后的 P=0.029,而冠狀動脈痙攣組(23.4%)與對照組無顯著性差異,從而推測-395A可能是冠心病獨立的基因危險因子。而 Rhee等〔15〕在對 274例因胸痛進行冠狀動脈造影檢查的韓國人 G-395A分型中發現,冠心病患者攜帶 A等位基因(GA+AA)的頻率(45.1%)與非冠心病患者(54.9%)相比,兩者無顯著差異(P=0.746),目前-395A等位基因是否是冠心病篩選基因還有待大樣本進一步證實。

3.2 Klotho基因與骨質疏松 人的骨質密度是基因和環境共同作用的結果,實際上 Ralston等〔16〕認為基因在骨質密度方面可能起到 50%～80%的作用,而且不同基因在不同年齡階段起著不同作用。由于 KL-/-小鼠可出現類似人類衰老的各種表型,包括骨質疏松,由此推測 klotho基因多態可能與骨質疏松有關。Kawano等〔8〕研究報道在 55例≥65歲絕經期婦女的小樣中提示 klotho基因可能與衰老有關的骨質疏松有關。Mullin等〔17〕報道與此相反,他們檢測 1 190例白種人絕經期婦女基因型及其各部位(包括髖骨、股骨頸、股骨粗隆和粗隆間)的BMD和其中 200例降鈣素,發現 G-395A和 C1818T兩基因多態與各部位的 BMD無關,而C1818T多態與血清降鈣素有關,TT型的降鈣素明顯大于 CT型,CT型大于 TT型。以上報道存在矛盾之處,提示G-395A和C1818T多態與人體骨質密度(BMD)可能無關,還有待進一步研究。在T352V與BMD的關系方面,Zarrabeitia等〔18〕檢測 362位西班牙男性的 F352V基因型和各部位(包括腰椎、股骨頸、髖骨和跟骨)的BMD,362位男性作為整體,FV+VV基因型的 BMD與FF的無明顯區別,≤53歲的中青年人群中,FV+VV基因型的 BMD明顯高于 FF基因型的。Riancho等〔10〕則認為女性的 F352V基因型和 BMD的關系與絕經狀態有關,絕經前F352V基因型和BMD無關,絕經后含FV+VV基因型的婦女BMD較含 FF基因型的高。由此推測F352V多態與BMD可能有一定的關系。FF基因型可能是骨質疏松的危險因素。

3.3 Klotho基因與糖代謝 由于 KL-/-小鼠血糖和胰島素水平下降且胰島素敏感性增加,相反,klotho過表達的小鼠胰島素抵抗,推測 klotho基因可能與糖尿病有關。Rhee等〔19〕檢測 251例健康韓國婦女快速血糖和胰島素抵抗指數(HOMA-IR)并用RT-PCR檢測 klotho基因型,發現 G-395A與血糖無關,而C1818T與血糖有關,含T等位基因血糖高于 C等位基因,HOMA-IR平均值也明顯增高,提示klotho基因可能是研究糖代謝的候選基因之一。Graham等〔20〕在對 1 793例無糖尿病家族史的 2型糖尿病患者、1 619例正常對照和來自 509例2型糖尿病家庭的 1 616例個體進行 klotho基因 F352V檢測,證明糖尿病患者 FV+VV基因型(28%)與正常對照(28%)無顯著差異,用FBAT軟件進行家系關聯性分析,發現V等位基因與糖尿病并無明顯關聯,提示在大型病例-對照研究和家系研究中并未發現 klotho基因 F352V與 2型糖尿病有關。

3.4 Klotho基因與腫瘤 Klotho的功能目前研究較多的是:①klotho蛋白抑制氧化應激、提高哺乳動物細胞對氧化應激的抵抗能力〔21〕;②抑制參與腫瘤發生發展的 IGF-1R的作用〔22～25〕;③klotho基因缺乏的小鼠具有免疫抑制作用〔1,26〕。以上均提示klotho可能是一個腫瘤抑制因子〔27〕。 Wolf等〔28〕在研究 klotho蛋白的表達與肺癌的關系時發現 klotho表達在正常肺組織較肺癌組織高,在癌組織中,癌塊較小的肺癌組織 klotho表達較較大的肺癌組織高,Wolf等的結論證實 klotho可能是一個腫瘤抑制因子。然而 Lingeng等〔29〕在研究卵巢癌與 klotho蛋白表達的關系時發現卵巢上皮細胞癌組織 klotho蛋白表達較正常組織增高,klotho表達可能與卵巢癌的進展有關,這一結論與Wolf等結果相矛盾。klotho蛋白與腫瘤的關系還待進一步研究。我們〔30〕在研究 klotho基因多態與胃癌的關系時發現胃癌患者-395A明顯高于正常對照,這是首次關于 klotho基因多態與腫瘤關系的研究。

4 展 望

Klotho是與衰老有關的新基因,目前其多態性與疾病易感性的研究主要集中在心血管、骨質疏松和糖代謝方面的研究,而與腫瘤和免疫功能關系的研究較少。有關klotho基因多態性與疾病的關系研究也應考慮這些方面。klotho基因功能與各種老年性疾病關系的研究幫助我們闡明衰老的分子機制及內在本質,為更好防治衰老性疾病、延長人類壽命奠定基礎。

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