非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的意義

吳 靜，鄭 浩，江 瑛，蘇 文，侯金佟，張 華

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院超聲診斷科，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，北京 100069）

非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是病理組織學(xué)改變與酒精性脂肪性肝炎相似，但無(wú)過量飲酒史的一種慢性疾病［1］。NASH作為隱源性肝硬化的重要病因，日益引起臨床的重視［2、3］。但NASH的發(fā)病機(jī)制至今并不完全清楚，NASH嚴(yán)重的肝細(xì)胞脂變和氣球樣變常成為局部缺血和缺氧的原因，而局部缺血和缺氧又進(jìn)一步加重NASH肝細(xì)胞損傷，表明肝臟血流動(dòng)力學(xué)的異?？赡艹蔀镹ASH病變進(jìn)展的重要因素之一。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知作用最強(qiáng)的血管生成正性調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增強(qiáng)多種血管生成因子的促血管生成效應(yīng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促使血管通透性增加的作用，局部缺血和缺氧是調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)的主要因素之一［4，5］。因此VEGF可能與NASH的發(fā)病有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用高脂飲食復(fù)制大鼠非酒精性脂肪肝損傷模型，通過高分辨率小動(dòng)物顯微超聲成像系統(tǒng)檢測(cè)門脈系統(tǒng)靜脈內(nèi)徑等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)肝臟VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平，旨在探討NASH大鼠肝臟血流動(dòng)力學(xué)的變化和VEGF在NASH的表達(dá)及其作用，為今后防治NASH提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型建立及分組

清潔級(jí)SD雄性大鼠110～130g 20只，由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK-（軍）2007-004。隨機(jī)分為對(duì)照組（10只，普通飼料喂養(yǎng)）和模型組（10只，高脂飼料即普通飼料基礎(chǔ)上加10％豬油和2％膽固醇喂養(yǎng)），飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境內(nèi)16周。

1.2 超聲檢查

采用Visual Sonics Vevo 770型超高頻小動(dòng)物彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率20～40MHz，測(cè)量肝臟大小、回聲強(qiáng)度、后方回聲衰減、肝緣圓鈍及肝內(nèi)血管顯示程度進(jìn)行評(píng)分（1為正常，2為輕度改變，3為明顯改變），取均值；測(cè)量門靜脈、脾靜脈和肝靜脈內(nèi)徑及最大血流速度（V），選用門靜脈長(zhǎng)軸切面，取最大值作為門靜脈內(nèi)徑（D）；計(jì)算門靜脈血流量應(yīng)用公式：

Q（ml/min）=π×（D/2）2×V×60。

1.3 血生化指標(biāo)檢測(cè)

腹主動(dòng)脈采血（隔夜禁食），肝素抗凝，常規(guī)制備血清。應(yīng)用Olympus AU640全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽固醇（TC）。

1.4 組織病理學(xué)檢查

取肝臟組織行冷凍切片和石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色，油紅O染色和Masson染色，觀察肝臟脂肪變性、氣球樣變和纖維化等病理變化。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)SP法染色，按說明書（PV-6002二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）規(guī)范進(jìn)行。切片脫蠟至水化，置3％過氧化氫，室溫30min，微波修復(fù)抗原。滴加5％BSA封閉液，37℃，30min；滴加VEGF單克隆抗體（sc-7269，Santa Cruz公司）1∶100稀釋液，4℃過夜；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（兔抗鼠IgG），37℃，10min；DAB避光顯色，鏡下控制顯色時(shí)間；蘇木精輕度復(fù)染。以PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照。

1.6 蛋白印記

稱取100mg肝組織，加入裂解液勻漿，4℃，以12 000g，離心15min，取上清蛋白定量。取100μg蛋白上樣進(jìn)行SDS/PAGE電泳，經(jīng)硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)移，以5％脫脂奶粉封閉，然后加入一抗（VEGF1∶600或GAPDH1∶5 000）4℃過夜。以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育，利用化學(xué)發(fā)光法顯色，結(jié)果曝光于膠片上。應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行吸光度分析，以VEGF和GAPDH的比值表示各組蛋白表達(dá)水平。

1.7 實(shí)時(shí)定量RT-PCR

用Trizol提取肝臟組織總RNA，按Promega公司RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)，ABI公司7300 System），按SYBR Green PCR Master Mix（美國(guó)ABI公司）試劑盒說明書，將大鼠肝臟cDNA同時(shí)行VEGF和18sRNA基因定量PCR。VEGF引物：正義鏈：5′-CGTCTACCAGCGCAGCTATTG-3′，反義鏈：5′-GCACACAGGACGGCTTGAA-3′，18 sRNA正義鏈：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，反義鏈：5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。反應(yīng)擴(kuò)增條件為0℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)。將檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定在PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct）作為模板初始濃度的間接指標(biāo)，結(jié)果用18sRNA進(jìn)行校正。Ct值越大，基因表達(dá)量就越小。用2—ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行溶解曲線分析和電泳以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 病理改變

肉眼觀察對(duì)照組肝臟色澤紅潤(rùn)，邊緣銳利；模型組肝臟體積增大，邊緣變鈍，呈灰黃色，表面可見黃白色不規(guī)則斑塊沉積。光鏡下觀察對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；模型組肝細(xì)胞排列紊亂，呈大小泡混合性脂肪變性，伴肝細(xì)胞氣球樣變性、并可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、碎片狀壞死和少量纖維組織增生（圖1，見彩插3）。

2.2 超聲表現(xiàn)

正常對(duì)照組圖像為肝實(shí)質(zhì)回聲均勻，肝內(nèi)管系組織顯示清晰；模型組肝臟增大，肝緣圓鈍，實(shí)質(zhì)回聲細(xì)密增強(qiáng)，后方組織明顯衰減，肝內(nèi)管系組織顯示不清。超聲評(píng)分與病理評(píng)分結(jié)果一致［6］。門靜脈內(nèi)徑增大，肝靜脈內(nèi)徑減小，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖2）。門靜脈流速和肝靜脈流速均下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 血生化指標(biāo)

與對(duì)照組比較，模型組周大鼠ALT、AST增高、TC、TG增高，差異具有顯著性（P＜0.05）（表1）。

圖2 大鼠肝臟超高頻超聲圖像及血流動(dòng)力學(xué)變化Fig.2 The high frequency ultrosound images of the liver and hemodynamic changes in the rats

表1 各組大鼠血生化指標(biāo)Tab.1 The serum biochemical parameters in the rats（±s）

表1 各組大鼠血生化指標(biāo)Tab.1 The serum biochemical parameters in the rats（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；*P＜0.05，compared with the control group.

組別Groups血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT（U/L）天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST（U/L）總膽固醇TC（mmol/l）對(duì)照組Control 43.55±8.96 126.83±27.47 1.57±0.34模型組Model 194.21±83.91* 362.57±117.13*3.17±2.17*

2.4 VEGF的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠肝組織VEGF蛋白表達(dá)量極低，僅在中央靜脈周圍個(gè)別肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF。模型組肝組織VEGF蛋白表達(dá)明顯增加，呈彌漫分布，陽(yáng)性細(xì)胞主要為肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞，輕度脂變的細(xì)胞比氣球樣變的細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)更為明顯。而增生的炎性細(xì)胞和星形細(xì)胞則低表達(dá)甚至不表達(dá)VEGF蛋白。VEGF蛋白的Western blotting結(jié)果表明：對(duì)照組和模型組均有VEGF蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖3，圖3A、3B見彩插3）。

圖3 各組大鼠肝臟VEGF蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of hepatic VEGF protein of each rat group

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，NASH大鼠肝臟VEGF mRNA表達(dá)水平明顯增加。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)曲線和溶解曲線結(jié)果表明，質(zhì)控良好，擴(kuò)增物為單一產(chǎn)物。模型組大鼠VEGF mRNA的水平大約是是對(duì)照組的3倍，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠肝臟VEGF mRNA水平Fig.4 The levels of hepatic VEGF mRNA in the rat groups

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用高脂復(fù)制大鼠NASH模型，與臨床高脂飲食所致的NASH有相似的外因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：此時(shí)不僅出現(xiàn)高膽固醇血癥，血清ALT及AST也顯著增高。病理檢查表現(xiàn)為肝細(xì)胞氣球樣變性和重度脂肪變性、伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞碎片狀壞死及纖維組織增生。表明病程已進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。

血液流變異常和血流動(dòng)力學(xué)的變化是脂肪肝病變發(fā)展的重要病因之一。研究證實(shí)肥胖、肝臟脂肪浸潤(rùn)可導(dǎo)致肝靜脈血流頻譜發(fā)生變化［7］。我們的研究結(jié)果也表明超高頻多普勒超聲可以較敏感地檢測(cè)非酒精性脂肪性肝病大鼠不同時(shí)期門脈系統(tǒng)血流動(dòng)力學(xué)變化［8］。本實(shí)驗(yàn)超聲檢查結(jié)果：表現(xiàn)為不僅肝臟增大，肝臟回聲前方彌漫增強(qiáng)，后方組織嚴(yán)重衰減至顯示不清，與脂肪肝的病理結(jié)果相一致，而且門靜脈內(nèi)徑增大，肝靜脈內(nèi)徑減小，靜脈流速減低，表明NASH大鼠伴有肝臟血流動(dòng)力學(xué)異常。此時(shí)一方面因脂代謝的異常導(dǎo)致血液黏度增加，影響肝臟的血流供應(yīng)，引起肝組織缺血、缺氧和局部酸血癥，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)內(nèi)糖元減少，脂肪堆積［7］。另一方面NASH發(fā)生時(shí)，由于肝細(xì)胞脂變和氣球樣變引起的肝實(shí)質(zhì)順應(yīng)性下降，而且隨著肝細(xì)胞腫脹增大，壓迫肝竇及肝內(nèi)血管，血流阻力加大，影響肝臟充盈和血液循環(huán)，肝靜脈順應(yīng)性的降低導(dǎo)致肝靜脈狹窄，流速降低。遠(yuǎn)端阻力的加大，使門靜脈血流速度減低，管徑增寬。肝竇與肝細(xì)胞間的交換障礙最終導(dǎo)致肝臟功能損害。

VEGF在肝源性疾病的研究表明［9-12］，在肝功能完全代償或部分代償時(shí)VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，而肝功能失代償時(shí)表達(dá)明顯下降。急性肝炎，肝硬化和肝癌患者血清VEGF水平明顯升高；在四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷大鼠和肝大部切除后的ob/ob小鼠肝臟VEGF水平明顯增加，VEGF通過與受體結(jié)合刺激肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖和星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)肝細(xì)胞再生及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但VEGF在非酒精性脂肪性肝炎的表達(dá)水平及其作用并不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組肝組織VEGF蛋白表達(dá)明顯增加，呈彌漫分布，陽(yáng)性細(xì)胞主要是肝細(xì)胞，腺泡Ⅲ區(qū)的肝細(xì)胞和外周未完全空化的肝細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)更為明顯。這可能與VEGF系缺氧誘導(dǎo)因子，而此區(qū)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)較門管區(qū)差，缺氧更為明顯，細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，NASH大鼠肝臟VEGF轉(zhuǎn)錄水平增加。此時(shí)肝細(xì)胞VEGF表達(dá)增加，可能是一種適應(yīng)反應(yīng)，通過誘導(dǎo)VEGF mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，促使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增加肝竇形成、誘導(dǎo)新生血管的形成，以改善肝細(xì)胞的供血供氧，最大限度地維持肝細(xì)胞功能，以迅速適應(yīng)脂質(zhì)底物的供給增加，減少血運(yùn)障礙，降低細(xì)胞缺血缺氧程度，促使肝細(xì)胞再生，阻止病變進(jìn)展，利于創(chuàng)傷修復(fù)。但由于VEGF誘導(dǎo)的新生血管的不成熟和其滲透作用，因此可能并不能完全糾正缺氧。而VEGF活性增加的同時(shí)也可致炎性滲出增多，星形細(xì)胞激活，可能增加纖維化的風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)于VEGF在NASH發(fā)病機(jī)制中的作用尚需進(jìn)一步研究，而這些更深入的研究將有助于今后更好的防治NASH。

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