長爪沙鼠高膽固醇血癥模型的建立與辛伐他汀的作用

李長龍，郭紅剛，石巧娟，盧領(lǐng)群，樓 琦，薩曉嬰

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實驗動物中心，杭州 310013）

心腦血管疾病是造成人類死亡率最高的疾病［1］。我國心腦血管疾病的發(fā)生率高達(dá)總?cè)丝诘?％，死亡率高達(dá)總發(fā)生率的50％［2］。高膽固醇血癥（hypercholesterolemia）是一種高脂血癥，主要由肝臟膽固醇代謝紊亂引起［3］，是導(dǎo)致心腦血管疾病重要的危險因子之一［4，5］。同時，高膽固醇血癥還可以導(dǎo)致糖尿病、脂肪肝、腎病綜合癥等多種疾病［4］。隨著人們生活水平的提高，脂類物質(zhì)在膳食中的比例不斷增加，脂代謝紊亂及高膽固醇血癥的發(fā)生率也不斷提高。因此，研究肝臟細(xì)胞膽固醇代謝紊亂發(fā)生的分子機制對預(yù)防和治療高膽固醇血癥、保護人類健康有著深遠(yuǎn)的意義［6，7］。

長爪沙鼠又稱蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus，Mongolian gerbil），是一種正在進行開發(fā)、有著廣闊應(yīng)用前景的多功能性的嚙齒類實驗動物，由于具有許多獨特的生物學(xué)特征，已被廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)研究中。長爪沙鼠血清TC水平對飼料中膽固醇很敏感，易于形成高膽固醇血癥。Hegsted報道，飼料中添加橄欖油、紅花油、椰子油等物質(zhì)，就可引起長爪沙鼠血漿總膽固醇（TC）水平迅速升高［8］。鐘民濤等用含有1％膽固醇的飼料飼喂長爪沙鼠4周，血漿中TC、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）均有極顯著的升高［2］；而實驗大、小鼠在相同條件下血漿TC、HDL-C和LDL-C均無顯著變化［2］。不僅如此，長爪沙鼠的血漿脂質(zhì)以低密度脂蛋白（LDL）顆粒為主［9］，并且在含高脂肪酸和高膽固醇飼料喂養(yǎng)下，以LDL-C顯著升高為主［10］，與人類極為相近。因此，長爪沙鼠被認(rèn)為是研究膽固醇代謝良好的模型動物［2，11-15］。目前有關(guān)長爪沙鼠易發(fā)高膽固醇血癥的機制還未見報道。

在人類、大、小鼠中的研究結(jié)果顯示，羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶是膽固醇合成的限速酶，是諸多調(diào)控因子調(diào)節(jié)膽固醇生物合成的靶點［16］。為了維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的穩(wěn)定，存在膽固醇合成反饋調(diào)控機制。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇減少時，調(diào)控因子激活HMG-CoA還原酶基因的表達(dá)，以增加膽固醇的生物合成［17］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇超載時，膽固醇反饋調(diào)節(jié)調(diào)控因子，在膽固醇反饋調(diào)控因子作用下，對HMG-CoA還原酶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用消失，以減少膽固醇合成［18］。本研究選擇辛伐他汀抑制羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶進而抑制內(nèi)源性膽固醇生物合成，通過分析長爪沙鼠的血清總膽固醇的變化情況，闡明長爪沙鼠在大量攝入膽固醇時內(nèi)源性膽固醇的合成情況，探索長爪沙鼠易發(fā)高達(dá)固醇血癥的機制。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

長爪沙鼠（清潔級），雄性50只，體重40～60g，來源于浙江省實驗動物中心【SCXK（浙）2008-0033】。動物實驗在浙江省實驗動物中心屏障環(huán)境【SYXK（浙）2008-0014】進行，按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。沙鼠飼喂60CO滅菌的營養(yǎng)配合飼料，飲用超濾水，籠器具、墊料等均經(jīng)121℃高壓滅菌，消毒20min。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

血清總膽固醇（TC）診斷試劑盒，批號：90598；血清甘油三（TG）診斷試劑盒，批號：C090697；血清白蛋白（ALB）診斷試劑盒，批號：90502；血清堿性磷酸酶（ALP）診斷試劑盒，批號：90490；血清血糖（GLU）診斷試劑盒，批號：90501；血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）診斷試劑盒，批號：90995；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）診斷試劑盒，批號：90609；血清總膽紅素（TBI）診斷試劑盒，批號：90265；血清總蛋白（TP）診斷試劑盒，批號：90371；上述試劑購自上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司。血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）診斷試劑盒，批號：11266/49861/1；血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）診斷試劑盒，批號11266/49862/2，購自德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司；血清總膽汁酸（TBA）診斷試劑盒，批號：20081020購自浙江奧的特生物技術(shù)有限公司。Autolab PM 4000全自動生化分析儀：意大利羅馬生產(chǎn)；低速自動平衡離心機：北京醫(yī)用離心機廠。

1.3 高脂飼料

高脂飼料配方在相關(guān)報道基礎(chǔ)上進行了調(diào)整［19］，由浙江省實驗動物公共服務(wù)平臺飼料生產(chǎn)基地制造，飼料配方：80.5％基礎(chǔ)飼料，膽固醇2％，膽鹽0.5％，豬油7％，蛋黃粉10％。

2 方法

2.1 動物分組與處理

健康雄性長爪沙鼠，隨機分為5組，每組10只，①正常對照組、②高脂模型組、③辛伐他汀干預(yù)組（高劑量組，8mg/（kg·d））、④辛伐他汀干預(yù)組（中劑量組，4mg/（kg·d））、⑤辛伐他汀干預(yù)組（低劑量組，2mg/（kg·d））。①和②組每天0.2mL生理鹽水灌胃、②、③、④和⑤組飼喂高脂飼料，自由進水進食，觀察動物一般情況。15d后，禁食12h，以乙醚麻醉，稱重，腹主動脈采血，分離血清；迅速取出肝臟并稱重，計算肝臟指數(shù)（肝臟濕重/體重）。

2.2 一般觀察

動物的體重，進食，運動，精神狀態(tài)的變化。

2.3 血清相關(guān)指標(biāo)

TG測定采用GPO-PAP法；HDL-C和LDL-C測定采用直接法；TC測定采用CHOD-PAP法；AST和ALT測定采用連續(xù)監(jiān)測法；TP測定采用雙縮脲法；ALB測定采用溴甲酚綠法；TBA測定采用重氮法；TBI測定采用循環(huán)酶法；GLU測定采用氧化酶法；具體操作按試劑盒說明書進行。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件單因素方差分析。實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示。

3 結(jié)果

3.1 一般觀察

體重變化數(shù)據(jù)結(jié)果見圖1所示。長爪沙鼠的體重變化呈平穩(wěn)的直線走行，各個時間段的體重變化差異都無顯著性（P＞0.05）。長爪沙鼠肝臟外觀變化明顯，正常對照組肝臟形態(tài)正常；模型組肝臟顏色變淡、包膜緊張、色澤灰、切面油膩；藥物組肝臟顏色比模型組深，但是藥物組間肝臟顏色差別不明顯。

3.2 血脂相關(guān)指標(biāo)

3.2.1 血清總膽固醇（TC）的變化：結(jié)果如表1所示：相對于正常對照組，模型組血清TC值在飼喂高脂飼料15d后有極顯著的增加（P＜0.01），該結(jié)果表明高脂飼料能夠短期內(nèi)極大程度增加長爪沙鼠TC含量。在辛伐他汀藥物組中，辛伐他汀表現(xiàn)劑量依賴性的降低TC含量，高劑量組和中劑量組與模型組之間分別有極顯著（P＜0.01）和顯著差異（P＜0.05）。表明辛伐他汀能夠有效抑制高脂飼料對長爪沙鼠血清膽固醇的升高作用。

圖1 辛伐他汀對長爪沙鼠模型體重、肝重和肝臟系數(shù)的影響Fig.1 The effect of Simvatatin on body weight，liver weight and liver coefficient in the gerbil models

3.2.2 血清三酰甘油（TG）的變化：結(jié)果如表1所示：在飼喂高脂飼料15d后，模型組與正常對照組血清TG沒有顯著差異（P＞0.05）；辛伐他汀在一定程度上升高TG含量，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異。該結(jié)果表明，高脂飼料長爪沙鼠血清TG含量影響不明顯。

表1 辛伐他汀對長爪沙鼠高膽固醇血癥模型的血脂指標(biāo)的影響Tab.1 The effect of Simvatatin on serum lipid parameters in the gerbil models of hypercholesterolaemia

3.2.3 血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的變化：結(jié)果如圖表1所示：飼喂高脂飼料15d后，相對于正常對照組，模型組HDL-C值有極顯著的增加（P＜0.01）。結(jié)果表明，高脂飼料能夠在短期內(nèi)快速增加長爪沙鼠血清HDL-C含量。在辛伐他汀藥物組中HDL-C含量呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性的降低，高劑量組與模型組之間差異有極顯著性（P＜0.01）。中劑量組和低劑量組的HDL-C含量也有明顯的降低，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，辛伐他汀能夠抑制高脂飼料對長爪沙鼠血清HDL-C含量的升高作用。

3.2.4 血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的變化：結(jié)果如圖表1所示：相對于正常對照組，模型組血清LDL-C值在飼喂高脂飼料15d后有約7倍的增加，結(jié)果表明，高脂飼料能夠短期內(nèi)快速增加長爪沙鼠血清LDL-C含量。在辛伐他汀藥物組中LDL-C含量呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性的降低，高劑量組、中劑量組與模型組之間差異有極顯著性（P＜0.01），低劑量組與模型組之間也有明顯的降低，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異。表明辛伐他汀能夠抑制高脂飼料對長爪沙鼠血清LDL-C含量的升高作用。

3.2.5 血清總膽汁酸（TBA）的變化：結(jié)果如表1所示：相對于正常對照組，模型組血清TBA值在飼喂高脂飼料15d后有顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果表明，高脂飼料能夠快速增加長爪沙鼠血清TBA含量。在辛伐他汀藥物組中，TBA含量呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性的增加，高劑量組、中劑量組與模型組之間酶差異有顯著（P＞0.05）。相對于模型組，低劑量組的TBA含量有極顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，辛伐他汀能夠促進血清中TBA含量的升高。

3.3 肝功能相關(guān)指標(biāo)

3.3.1 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的影響：AST和ALT是肝臟功能的重要指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，高脂飼料有增加AST和ALT的趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，高脂飼料在一定程度上破壞了肝細(xì)胞的功能。辛伐他汀也具有增加AST和ALT活性的趨勢；結(jié)果說明，辛伐他汀對肝臟功能具有不良的影響。該結(jié)果與吳宗貴（2005）報道一致［20］。

3.3.2 對血清總蛋白（TP）和白蛋白（ALB）的影響：結(jié)果如表2所示，在5個組間血清總蛋白和白蛋白沒有顯著變化（P＞0.05），說明高脂飼料和辛伐他汀對TP和ALB沒有顯著影響。

3.3.3 對膽紅素（TBI）的影響：結(jié)果如表2所示，相對正常對照組，模型組膽紅素有極顯著的增加（P＜0.01），但是辛伐他汀組相對于模型組差異沒有顯著性（P＞0.05）。說明辛伐他汀不能有效抑制高脂飼料對膽紅素的影響。

3.4 血糖（GLU）的變化

結(jié)果如圖表1所示：相對于正常對照組，模型組血清GLU值在飼喂高脂飼料15d后沒有顯著變化（P＞0.05）。在辛伐他汀藥物組中GLU含量呈現(xiàn)明顯的降低，三個劑量組與模型組和空白之間差異均有極顯著性（P＜0.01）。

4 討論

表2 辛伐他汀對長爪沙鼠高膽固醇血癥模型的生化指標(biāo)的影響Tab.2 The effect of Simvatatin on biochemical parameters in the gerbil models of hypercholesterolaemia

在我國，心腦血管疾病的發(fā)生率高達(dá)總?cè)丝诘?％，死亡率高達(dá)總死亡率的50％。其中冠心病的發(fā)病率與死亡率在逐年上升。近年來，以冠心病和腦卒中為主的心血管病已逐漸成為我國居民的第一位死亡原因［21］。大量流行病調(diào)查顯示：高脂血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要原因，而動脈粥樣硬化是心腦血管疾病最主要的病理基礎(chǔ)，同時高脂血癥還可以加重糖尿病、脂肪肝、腎病綜合癥等多種疾病，對人體的健康有巨大危害［22，23］。積極開展血脂代謝的研究，對人類健康有著深遠(yuǎn)的意義。一個發(fā)病機理清楚動物模型對藥物研發(fā)具有至關(guān)重要的意義。

結(jié)果顯示，高脂飼料在飼喂長爪沙鼠15d后，TC、HDL-C、LDL-C和TBA均有顯著的升高，其中LDL-C和TC升高最為明顯，TG和GLU沒有顯著變化。該結(jié)果表明，利用高脂飼料建立長爪沙鼠高膽固醇血癥模型是成功。該結(jié)果與鐘民濤（2006）等結(jié)果一致。在本模型中，LDL-C的增加幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HDL-C升高幅度，說明長爪沙鼠血漿膽固醇是以LDL為主要的載體，與人類高膽固醇血癥的更為相似［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，通過高脂飼料建立的長爪沙鼠高膽固醇血癥中膽汁酸的濃度有很大的升高，表明在高脂飼料時長爪沙鼠的膽固醇代謝有顯著的增加，但是，膽固醇代謝增加量還不足以維持長爪沙鼠體內(nèi)膽固醇正常水平。

肝臟是合成膽固醇的最主要器官。本研究中，高脂飼料對長爪沙鼠肝臟重量沒有明顯的影響，但是飼喂高脂飼料的動物肝臟顏色變淡，說明肝臟細(xì)胞脂肪沉積顯著增加。AST、ALT、TP及ALB均升高但無統(tǒng)計學(xué)差異，高脂飼料能夠增加血清膽紅素的含量。結(jié)果說明高脂飼料已經(jīng)造成長爪沙鼠肝細(xì)胞損傷。

辛伐他汀是膽固醇生物合成關(guān)鍵酶（HMGCoA）的特異性抑制劑，特異性抑制細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇的生物合成，在改善脂代謝紊亂，降低心血管事件發(fā)生率的治療中受到高度評價［16，24］。在本研究中辛伐他汀能夠顯著（P＜0.01）降低血清TC、LDLC和HDL-C的含量，該結(jié)果說明辛伐他汀能夠改善長爪沙鼠的高脂血癥，表明利用高脂飼料建立的長爪沙鼠高膽固醇血癥模型具有可恢復(fù)性，可以用于相關(guān)藥物的研究。血清TG水平?jīng)]有顯著（P＞0.05）的變化。膽汁酸是膽固醇代謝產(chǎn)物，血清膽汁酸的含量是膽固醇代謝為膽汁酸的一個指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，膽汁酸水平隨著辛伐他汀濃度的增加而增加，其中低濃度組具有最低膽汁酸水平，達(dá)到26.60±10.36μmol/L，與正常對照組相近。該結(jié)果說明，辛伐他汀通過抑制膽固醇生物合成進而降低了膽固醇的代謝，但是劑量關(guān)系有待于進一步研究。雖然在正常對照組和模型組中血糖水平?jīng)]有顯著變化，但在藥物組中血糖有極顯著（P＜0.01）的降低。結(jié)果說明，辛伐他汀有可能同時治療高膽固醇血癥和高血糖。該結(jié)果與沈映雪（2008）報道一致［25］。上述結(jié)果表明，在高脂飼料建立的長爪沙鼠高膽固醇血癥模型中雖然膽固醇攝入量大大增加，但是機體內(nèi)膽固醇生物合成仍然在進行，內(nèi)源性膽固醇量在血清總膽固醇中的比例依然很高。

長爪沙鼠膽固醇代謝與其他實驗動物存在很大差別，其血漿膽固醇含量對高脂飼料非常敏感并且其載脂蛋白變化與人類相似，被認(rèn)為是高脂血癥良好的研究模型。但是長久以來長爪沙鼠易發(fā)高膽固醇血癥的機制尚未有研究報道。本研究選擇膽固醇合成限速酶（HMG-CoA）特異性抑制劑辛伐他汀探索長爪沙鼠易發(fā)高膽固醇血癥的機制。結(jié)果顯示，辛伐他汀能通過抑制HMG-CoA還原酶（膽固醇合成限速酶）活性抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，進而抑制長爪沙鼠高膽固醇血癥的發(fā)生，而不經(jīng)辛伐他汀處理時，HMG-CoA還原酶活性仍很高，內(nèi)源性膽固醇大量增加，從而造成高膽固醇血癥。推測長爪沙鼠膽固醇代謝中存在與大、小鼠不同的、特殊的反饋調(diào)節(jié)機制，使長爪沙鼠對膽固醇更加敏感，更易發(fā)生高膽固醇血癥

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