貴州四個民族人群線粒體DNA編碼區的多態性

李彬彬，鐘復光，易紅生，王先然，李良芳，王麗蘭，吳立甫

（1.廣東醫學院病理生理學教研室，東莞 523808；2.貴陽醫學院醫學科學研究所，貴陽 550004；3.貴州省天柱縣人民醫院，天柱 556700；4.貴州省赫章縣人民醫院，赫章 553200；5.貴州省務川縣人民醫院，務川 564300）

人類線粒體NA（mitochondrial DNA，mtDNA）是存在于細胞核外的唯一遺傳物質，為閉環雙鏈結構，由16569對堿基組成，包括非編碼區和編碼區（編碼37個基因）。線粒體DNA由于嚴格的母系遺傳、進化速率快、群體內變異大、分子結構簡單、拷貝數多等特性，已成為群體遺傳學、考古學以及法醫學等領域非常有用的遺傳標記。

目前對mtDNA多態性的研究主要集中在非編碼區中的兩個高突變區（hypervariable segmentⅠandⅡ，HVSⅠ、Ⅱ），但由于這兩個區域不能提供足夠的多態信息量，識別能力有限，因此，對mtDNA編碼區進行單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphis m，SNP）研究，將為進一步建立mtDNASNP數據庫以及線粒體SNP基因座在考古學、進化學和法醫學個人識別等應用奠定基礎［1，2］。本文采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCRRFLP）技術及DNA測序法對貴州土家族、侗族、仡佬族和彝族共145例樣本mtDNA編碼區9個多態位點進行了研究，為各少數民族群體遺傳學研究提供新的數據。

1 材料和方法

1.1 樣本采集及mtDNA提取

隨機選取145例健康婦女所生胎兒的胎盤標本，其中土家族38例，侗族37例，仡佬族40例，彝族30例，分別采自貴州省天柱、道真、沿河、赫章等縣市的民族聚居地。各樣本家庭內部3代均為同一民族，彼此間無直接血緣關系。按王文等［3］的堿變性法從胎盤組織中提取mtDNA，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.2 mtDNA編碼區的PCR擴增

依據文獻報道［4，5］，選取mtDNA編碼區在亞洲人群中多態性較高的8個SNP（A10398G、C10400T、A663G、A4833G、C5178A、G7598A、G12406A、A13263G）基因座及COⅡ/tRNAlys基因間9bp缺失，對相應片段進行PCR擴增。反應參數為94℃預變性5min，94℃變性30s、Tm退火40s、72℃延伸40s，共30個循環，最后72℃延伸5min。擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳和8％聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。引物序列、退火溫度及片段長度見表1。

1.3 擴增產物的RFLP檢測

將PCR擴增產物參照表1進行相應的限制性酶切反應。所用限制性內切酶DdeⅠ、HaeⅢ、AluⅠ、HhaⅠ、HpaⅠ均購自北京華美生物公司。酶切反應體系為：PCR產物4μL，限制性內切酶2～4U，10×buffer 1μL，加滅菌水至10μL，37℃溫育過夜。酶切產物用3％瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測。

表1 mtDNA編碼區的PCR反應參數及RFLP分析Tab.1 The reaction parameters of PCR and RFLP analyses in the mtDNA coding region

1.4 擴增產物的測序

選取部分樣本的PCR擴增產物經2％瓊脂糖電泳后用小量膠回收試劑盒（大連寶生物工程有限公司）進行回收純化，采用BigDyeT M Teminator Cycle Sequencing Ready試劑盒（美國PE公司）進行序列測定。測序結果與mtDNA修訂劍橋標準序列（revised cambridge reference sequence，rCRS）［6］進行比對。

1.5 數據分析

根據PCR-RFLP及測序結果，計算貴州4個民族群體的mtDNA 9bp缺失頻率及8個SNP基因座的等位基因頻率。各位點堿基完全相同者視為同一單倍型，統計各單倍型分布頻率。

2 結果

2.1 PCR-RFLP及測序結果

對貴州4個民族人群145例樣本進行擴增結果表明，mtDNA 9bp缺失頻率分別為土家族18.4％（7/38），侗族29.7％（11/37），仡佬族25％（10/40），彝族16.7％（5/30），平均缺失頻率為22.8％。其他編碼區RFLP分析共發現有187個擴增片段存在特異突變位點，進一步測序分析確定其突變類型（表2）。

表2 貴州4個群體8個mtDNA SNP基因座的等位基因頻率Tab.2 Allele frequencies of 8mtDNA SNP loci in four populations from Guizhou

2.2 mtDNA編碼區的多態性分布

貴州4個民族群體8個mtDNA SNP基因座的等位基因頻率分布見表2。在145例樣本中，共檢出14種單倍型，單倍型及其頻率分布見表3。

表3 9個mtDNA多態位點在貴州4個民族群體的單倍型分布Tab.3 Haplotype distribution of 9mtDNA polymorphism site in four populations from Guizhou

注：＊：“1”表示存在mtDNA 9bp缺失；“2”表示沒有9bp缺失。Note：＊：“1”denotes the presence of the 9bp deletion，“2”denotes nondeletion

3 討論

近年來研究發現，僅通過mtDNA高變區對人群進行世系發育分析，得出的結論往往不能完整、真實地反映系統關系，而結合編碼區的一些特征位點，則能更加準確、有效地界定群體的mtDNA世系發育關系［4，5，7］。在法醫學鑒定中，由于mtDNA為單倍型遺傳［8］，僅僅依靠mtDNA高變區內的SNP，有時很難將兩個無關個體完全區分開，常需要增加編碼區的檢測位點才能提高mtDNA的個體識別能力［2，9］。同時，編碼區信息也將為某些線粒體相關遺傳病的研究提供基本數據資料。

有研究表明，人類mtDNA COⅡ/tRNAlys基因間有2個串聯重復的9bp（CCCCCTCTA）序列，此重復序列中一個重復單位的缺失，在亞洲人以及祖先是亞洲人的群體中很普遍［10］，也是檢測人類群體多態性的重要指標。不同人種群、不同地域人群mtDNA 9bp缺失頻率不同［11，12］。本次研究的貴州4個民族群體的9bp缺失頻率范圍為16.7％～29.7％，平均缺失頻率為22.2％，與已報道的［12］我國西南地區苗族（32.4％）、傣族（23.5％）和白族（16.7％）等群體較接近，但明顯高于北方的蒙古族（4.0％）、維吾爾族（3.3％）和哈薩克族（0.0％）等，這與目前認為的南方民族人群的缺失頻率要高于北方民族人群是相一致的［12］。

相對于非編碼區的高突變率，mtDNA編碼區的序列比較穩定，堿基突變較少。依據文獻報道［4，5］，我們選取了在亞洲人群中具有較高多態性的8個mtDNA編碼區SNP基因座對貴州4個少數民族群體進行了初步研究。在所檢測的基因座中，10398 A→G、10400 C→T突變在4個群體中較普遍，是兩種古老的突變類型，在已報道［13］的國內各少數民族群體中均有較高的分布頻率。此外，土家族人群663G的多態性頻率為13％，侗族人群12406A的多態性頻率為13％，仡佬族人群5178A的多態性頻率為20％，彝族人群663G、12406A的多態性頻率為23％、27％，與相應位點其他民族的分布頻率存在較大差別。這些結果提示在貴州4個民族群體中可能存在不同的mtDNA編碼區突變熱點。

本次研究的4個民族均來自貴州邊遠山區，山嶺阻隔，地形相對封閉，各民族之間隔離程度較高，民族特異性保存較好。在145例樣本9個多態位點中共檢測出14種單倍型，其中H1、H13、H12單倍型占有較高的比例，分別為19.3％、17.2％和15.2％，占總分析樣本的51.7％。從單倍型的分布來看，仡佬族的單倍型類型最多，有11種，土家族有10種，侗族有8種，彝族最少，只有6種，不同民族在單倍型分布頻率上存在一定差異。

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