單側(cè)輸尿管結(jié)扎再通大鼠模型的建立方法及其評(píng)價(jià)

董飛俠，何立群，2，黃 迪，張新志

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎內(nèi)科、肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203；2.上海市高校中醫(yī)內(nèi)科E-研究院，上海 201203）

單側(cè)輸尿管節(jié)扎（UUO）模型作為經(jīng)典的腎小管間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型為學(xué)術(shù)界所公認(rèn)［1-3］。但是UUO模型只能觀察梗阻后腎組織的組織形態(tài)學(xué)變化，對(duì)于受損腎臟的功能難以評(píng)價(jià)，和臨床實(shí)際遇到的輸尿管梗阻以及不全梗阻患者治療后解除梗阻后功能恢復(fù)以及病理形態(tài)好轉(zhuǎn)的情況不相符合，鑒于此，建立一種既能觀察梗阻后腎臟病理形態(tài)學(xué)變化又能研究其功能水平以及體現(xiàn)這二者之間的聯(lián)系的新模型，為臨床研發(fā)治療腎纖維化藥物提供新的研究對(duì)象顯得尤為必要。通過(guò)反復(fù)研究和實(shí)踐我們發(fā)明了單側(cè)輸尿管彈性塑膠加壓結(jié)扎再通模型（獲國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利號(hào)：200910057757.3），進(jìn)一步發(fā)展和完善了研究腎小管間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠54只，體重200±20g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)0058668）。分籠飼養(yǎng)于12h光照，相對(duì)濕度45％左右的飼養(yǎng)籠中，動(dòng)物自由飲水、攝食，室溫喂養(yǎng)。彈性塑膠管由PVC材料自行制作，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心為標(biāo)準(zhǔn)的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 分組和造模

54只SPF級(jí)SD雄性大鼠，其中18只作為再通組（A組）；18只接受經(jīng)典單側(cè)輸尿管結(jié)扎造成UUO模型（B組）；另18只為假手術(shù)組（C組）。再通組在接受左輸尿管植入彈性管脂肪墊加壓結(jié)扎梗阻后第7日后接受第二次手術(shù)，在第二次手術(shù)中，取出植入彈性管，疏通左側(cè)輸尿管，從而解除左腎梗阻，同時(shí)將右腎包膜分離，4號(hào)線結(jié)扎右側(cè)輸尿管。術(shù)后記錄大鼠的生存狀況、尿量。分別于術(shù)后第7和14日、21日各處死6只再通組大鼠、6只UUO組大鼠和6只假手術(shù)組大鼠，通過(guò)腹主動(dòng)脈取血，監(jiān)測(cè)腎功能水平，尿NAG，從而了解左腎功能，動(dòng)態(tài)觀察腎組織形態(tài)的改變。所有大鼠處死后取出左腎，去處包膜后縱行切開腎臟，進(jìn)行腎臟大小、腎實(shí)質(zhì)厚度測(cè)量，一部分腎組織固定后行病理檢查、免疫組化染色（α平滑肌動(dòng)蛋白）。

1.3 模型建立的評(píng)價(jià)方法

1.3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1.1 腎功能的測(cè)定：血肌酐、尿素氮用常規(guī)生化測(cè)定方法檢測(cè)。

1.3.1.2 腎小管功能的測(cè)定：尿NAG的測(cè)定：選用上海亞都生物技術(shù)經(jīng)營(yíng)部提供的尿NAG含量測(cè)定試劑盒，采用EL ISA法，用酶標(biāo)儀測(cè)定，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，步驟略。

1.3.1.3 大鼠的腎臟病理檢測(cè)：用MASS ION染色，觀察腎小球、腎小管和間質(zhì)的病理變化。

1.3.1.4 免疫組化染色：α平滑肌動(dòng)蛋白，采用SABC法。

1.3.1.5 腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)：腎組織Masson特染，光鏡觀察。在PAS-9000高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)下計(jì)算腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)。高倍鏡（×200）下隨機(jī)選取6個(gè)不重疊視野測(cè)定小管間質(zhì)纖維化面積與同視野小管間質(zhì)總面積的百分比，進(jìn)行半定量評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無(wú)病變；1分：＜25％；2分：26％～50％；3分：＞50％。每張切片取6個(gè)視野的平均積分，再在各組取平均值。

1.3.2 免疫組化結(jié)果分析：在每張切片不包含腎小球和血管的間質(zhì)區(qū)域隨機(jī)選取20個(gè)高倍鏡視野（×200，HPF），用PAS-9000高清晰彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)對(duì)所選取視野中免疫組化陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性染色面積占總視野面積的百分比，并計(jì)算其均值即平均面密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 造模各組腎功能比較

造模14d后UUO組和再通組的肌酐、尿素氮都顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01），說(shuō)明造模成功，并且再通組和UUO組Scr比較具有顯著差異（P＜0.05）。造模21d后UUO組和再通組的肌酐、尿素氮都顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；同時(shí)再通組與UUO組相比有明顯下降趨勢(shì)，并且再通組和UUO組Scr比較具有顯著差異（P＜0.05），造模28d后UUO組和再通組的肌酐、尿素氮都顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；同時(shí)與UUO組28d后相比再通組肌酐、尿素氮有明顯下降趨勢(shì)（P＜0.01），說(shuō)明再通造模成功對(duì)腎功能恢復(fù)的優(yōu)勢(shì)（表1）。

2.2 造模各組尿NAG比較

再通組的尿NAG呈動(dòng)態(tài)變化，隨著再通時(shí)間的增加，尿NAG排出逐漸減少，證明腎小管功能的逐步恢復(fù)，而UUO組的尿NAG逐步增高，證明腎小管功能在逐步惡化加重。再通組分別與UUO組14、21、28d比較尿NAG都差異顯著（P＜0.01）。證明再通組更有利于腎小管功能恢復(fù)（表2）。

表1 再通組以及UUO組造模后腎功能14d、21d和28d動(dòng)態(tài)改變Tab.1 RUUO group and UUO group renal function 14d，21d and 28d dynamic state range

表2 再通組以及UUO組14d、21d和28d尿NAG動(dòng)態(tài)變化Tab.2 RUUO group and UUO group urine NAG 14d，21d and 28d dynamic state range

2.3 造模各組腎纖維化指數(shù)變化

UUO組和再通組和假手術(shù)組比較均差異極顯著（P＜0.01）。隨著再通7d、14d、21d模型組腎纖維化指數(shù)逐漸減低，纖維化程度逐漸減輕，14d和UUO組比較雖有差別，但差異不顯著，21d和UUO組比較差異顯著（P＜0.05），28d和UUO組比較差異極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明隨著梗阻解除再通組的腎臟病理有明顯的好轉(zhuǎn)，且與腎小球和腎小管的功能恢復(fù)相一致（表3）。

表3 再通及UUO組腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)14d、21d和28d動(dòng)態(tài)變化Tab.3 RUUO group and UUO group renal tubule and interstitial fibrosis index 14d，21d and 28d dynamic state range

2.4 造模各組腎組織α-SMA的變化

造模14d、21d和28d后UUO和再通組的α-SMA顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01），說(shuō)明腎組織有顯著的纖維化表現(xiàn)。而在再通造模14d、21d和28d后和UUO組比較α-SMA有顯著下降（P＜0.01）（表4）。

表4 再通組以及UUO組α-肌動(dòng)蛋白14d、21d和28d動(dòng)態(tài)變化Tab.4 RUUO group and UUO groupα-SMA 14d，21d and 28d dynamic state range

2.5 造模后各組病理變化（圖1～8見(jiàn)彩插7）

假手術(shù)組，Masson染色顯示腎小管間質(zhì)未見(jiàn)明顯病變（圖1，圖2）。UUO術(shù)后第14天，Masson染色顯示腎組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，腎間質(zhì)水腫，部分小管消失，集合管，遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀，管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落壞死的上皮細(xì)胞，遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)纖維化輕（圖3）。再通組術(shù)后14d，Masson染色顯示部分近端小管保存尚好，腎組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)但是較UUO模型組明顯減少。部分近端腎小管擴(kuò)張程度輕，部分集合管，遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀但未見(jiàn)小管空泡變性，纖維化程度較UUO組術(shù)后14d輕（圖4）。UUO術(shù)后第21天，Masson染色顯示腎組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，腎間質(zhì)水腫，部分近端小管擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落壞死的上皮細(xì)胞，遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張，中度腎間質(zhì)纖維化（圖5）。再通組術(shù)后21d，Masson染色顯示部分近端小管上皮細(xì)胞空泡變性，管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落壞死的上皮細(xì)胞，未見(jiàn)小管萎縮消失，集合管，遠(yuǎn)曲小管病變程度較輕，腎間質(zhì)纖維化輕（圖6）。UUO術(shù)后第28天，Masson染色顯示片狀分布的腎小管萎縮和擴(kuò)張，損傷萎縮腎小管周圍見(jiàn)到代償性肥厚擴(kuò)張的腎小管，腎小管出現(xiàn)動(dòng)脈硬化樣改變和不同程度的腎間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)。部分小管萎縮消失，重度腎間質(zhì)纖維化（圖7）。再通組術(shù)后28d，Masson染色顯示部分近端小管保存尚好，未見(jiàn)遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張，未見(jiàn)腎小管空泡變性，腎間質(zhì)纖維化程度較輕（圖8）。

2.6 造模后各組α-SMA變化（圖9～16見(jiàn)彩插7）

α-SMA免疫組化染色見(jiàn)陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色，陰性對(duì)照組未見(jiàn)棕黃色顆粒在腎小管間質(zhì)的沉積（圖9，圖10）。UUO組α-SMA在14d時(shí)，在腎小管間質(zhì)有明顯棕黃色顆粒樣物質(zhì)表達(dá)，隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，UUO組α-SMA在21d和28d時(shí)棕黃色顆粒樣物質(zhì)表達(dá)逐漸增多，表達(dá)部位主要在腎小管間質(zhì)（圖11、圖13、圖15）。在各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上，RUUO組棕黃色顆粒樣物質(zhì)表達(dá)逐漸減少（圖12、圖14、圖16）。RUUO組α-SMA的表達(dá)較UUO組輕，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異（P＜0.01）。

3 討論

臨床中因?yàn)檩斈蚬芄Ｗ杌蛘卟蝗Ｗ鑼?dǎo)致的腎纖維化時(shí)有發(fā)生，然而對(duì)于腎纖維化的治療至今缺乏有效的辦法。同時(shí)目前的研究已證實(shí)，腎間質(zhì)纖維化程度與腎功能減退的相關(guān)性比腎小球病變與腎功能減退相關(guān)性更為密切。單側(cè)輸尿管節(jié)扎（UUO）模型制作相對(duì)簡(jiǎn)單，有較好的重復(fù)性，腎間質(zhì)纖維化發(fā)生迅速，是目前公認(rèn)的研究腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的理想模型，但是由于梗阻導(dǎo)致腎纖維化的不可逆性，所以觀察藥物干預(yù)治療效果就存在較大的局限性［4］。而單側(cè)輸尿管彈性塑膠加壓結(jié)扎以及再通模型既能觀察梗阻后腎臟病理形態(tài)學(xué)變化又能研究其功能水平以及體現(xiàn)這二者之間的聯(lián)系的新模型，為臨床研發(fā)預(yù)防和治療腎纖維化藥物提供新的研究對(duì)象。

單側(cè)輸尿管梗阻后，腎實(shí)質(zhì)受壓，局部血流量降低，使腎小管缺血，變性，萎縮，甚至消失。損傷的腎小管又是多種炎癥和促纖維化因子的主要來(lái)源，促進(jìn)和加重了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生［5，6］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行UUO術(shù)后第7天，梗阻側(cè)腎組織即出現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，部分近端小管上皮細(xì)胞空泡變性，管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落壞死的上皮細(xì)胞，遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張。第14天，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及增殖更為明顯，部分小管消失，集合管，遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀，皮質(zhì)變薄，出現(xiàn)間質(zhì)纖維化。第21天，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞增殖，皮髓質(zhì)變薄，間質(zhì)纖維化進(jìn)一步加重。第28天，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少，皮質(zhì)極薄，部分小管萎縮消失，纖維化顯著，而實(shí)驗(yàn)過(guò)程中腎小球病變均不明顯。進(jìn)行腎小管損害程度及腎間質(zhì)纖維化定量分析顯示：隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，腎小管損害的比率及腎間質(zhì)纖維化程度呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)加重的過(guò)程。而再通組則和UUO相反，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)好轉(zhuǎn)的過(guò)程。

觀察UUO術(shù)后梗阻側(cè)腎臟外觀發(fā)現(xiàn)，隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，UUO組梗阻側(cè)腎臟顯著增大腫脹，出現(xiàn)嚴(yán)重積水，表面不平，灰紅相間，包膜顯著增厚，而在再通組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上，再通側(cè)腎臟腫大及積水程度較輕，色澤較紅潤(rùn)，說(shuō)明再通可以改善梗阻腎積水及腫脹程度。術(shù)后第14天，由于梗阻后的早中期病變是以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，小管擴(kuò)張為主（圖3）。再通組病變較輕（圖4）。UUO術(shù)后第21～28天，隨著腎盂積水的加重，腎實(shí)質(zhì)逐漸變薄，間質(zhì)纖維化加重（圖5，圖7）。再通組腎盂積水的減輕，腎實(shí)質(zhì)逐漸變厚，間質(zhì)纖維化逐漸恢復(fù)（圖6，圖8）。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有顯著性差異。手術(shù)后第14天UUO組的血尿素氮、肌酐值開始升高，第21～28天，血尿素氮、肌酐值反而下降并基本恢復(fù)正常，這可能與尿路梗阻后引起腎小球囊內(nèi)壓增高，腎臟局部血流動(dòng)力學(xué)紊亂，導(dǎo)致腎小球慮過(guò)率下降有關(guān)，并提示急性單側(cè)輸尿管梗阻后，大鼠腎功能有一個(gè)急性失代償逐漸過(guò)渡到對(duì)側(cè)腎臟代償?shù)倪^(guò)程。而再通組腎功能呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)好轉(zhuǎn)的過(guò)程。提示7d造成的早中期腎纖維化是可以部分逆轉(zhuǎn)的［7］。由于本模型研制成功為進(jìn)一步研究腎纖維化逆轉(zhuǎn)時(shí)間窗口進(jìn)行有效的藥物干預(yù)或找到不可逆轉(zhuǎn)的腎纖維化時(shí)間點(diǎn)成為可能。

UUO術(shù)后梗阻側(cè)腎臟出現(xiàn)了一系列病理變化。UUO組腎小管間質(zhì)纖維化損害隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸纖維化，直到終末期。再通組在各時(shí)間點(diǎn)的腎小管損害和間質(zhì)纖維化程度要顯著低于UUO組，再通組腎小管間質(zhì)纖維化損害隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸好轉(zhuǎn)。說(shuō)明再通組能改善輸尿管梗阻后的小管間質(zhì)損害，和UUO組比較呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)好轉(zhuǎn)的過(guò)程［8］。

在UUO模型中，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞迅速增殖，部分腎小管上皮細(xì)胞還可發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量α平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）。本研究免疫組化顯示：兩組相比，UUO組α-SMA的表達(dá)隨病程進(jìn)展逐漸增加。而再通組α-SMA表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均顯著低于同期UUO組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性（P＜0.01），提示再通組腎間質(zhì)纖維化的逆轉(zhuǎn)可能與下調(diào)α-SMA的表達(dá)有關(guān)。綜上所述，從外觀上看，再通組可以改善梗阻腎積水及腫脹程度，病理改變顯示，再通組可以明顯減輕腎小管間質(zhì)的損傷程度及間質(zhì)纖維化程度及淋巴單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，并能下調(diào)α-SMA的表達(dá)，結(jié)合病理的好轉(zhuǎn)，再通組腎功能也相應(yīng)好轉(zhuǎn)。為臨床和實(shí)驗(yàn)藥物研究腎小管間質(zhì)纖維化提供了一個(gè)理想的早中期腎纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象［9，10］。

［1］Klahr S，Morrissey J.Obstructive nephropathy and renal fibrosis［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2002，283（5）：F861-875.

［2］王海燕.腎臟病學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：620-623.

［3］郭華，鄒萬(wàn)忠.腎小管間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備方法［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2003，19（2）：211-212.

［4］Pang M，Kothapally J，Mao H，et，al.Inhibition of histone deacetylase activity attenuates renal fibroblast activation and interstitial fibrosis in obstructive nephropathy［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2009，12（7）：282-288.

［5］Chevalier RL，F(xiàn)orbesMS，Thornhill BA.Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy［J］.Kidney Int，2009，75（11）：1145-1152.

［6］NishidaM，Hamaoka K.Macrophage phenotype and renal fibrosis in obstructive nephropathy［J］.Nephron Exp Nephrol，2008，110（1）：31-36.

［7］Chevalier RL.Chronic partial ureteral obstruction and the developing kidney［J］.Pediatr Radiol，2008，38（Suppl1）：S35-40.

［8］ThornhillBA，F(xiàn)orbesMS，Marcinko ES，et，al.Glomerulotubular disconnection in neonatal mice after relief of partial ureteral obstruction［J］.Kidney Int，2007，72（9）：1103-1112.

［9］Chevalier RL.Obstructive nephropathy：towardsbiomarker discovery and gene therapy［J］.Nat Clin Pract Nephrol，2006，2（3）：157-168.

［10］Chevalier RL.Specificmolecular targeting of renal injury in obstructive nephropathy［J］.Kidney Int，2006，70（7）：1234-1243.