S-甲基異硫脲對大鼠門脈高壓癥食管靜脈曲張的影響

任崇仁，鮑民生，曹杜娟

（山西醫科大學第一臨床醫院，太原 030001）

門脈高壓癥食管靜脈曲張破裂出血在臨床上屢見不鮮，是治療的重點難點。NO過多產生被認為是門脈高壓食管靜脈曲張的主要原因之一［1］，有文獻報道非選擇性的一氧化氮合酶抑制劑通過降低NO濃度可改善門脈高壓大鼠食管靜脈曲張［2］。

目前發現可以合成NO的酶即總一氧化氮合酶（TNOS）共有兩類：一類為組織型（cNOS），主要負責基礎NO的合成，生理狀態下即表達，調節各種生理功能；另一類為誘導型（iNOS），生理狀態下不表達，受到如內毒素等的刺激時催化合成非生理濃度的大量NO，產生一系列病理作用［3］。國外學者發現在門脈高壓大鼠的食管黏膜中iNOSmRNA比cNOSmRNA增多更顯著［4］。推測iNOS產生的大量NO在大鼠門脈高壓癥食管靜脈曲張的發病過程中可能發揮了重要作用。

本實驗研究iNOS的特異性抑制劑S-甲基異硫脲（S-methylisothiourea，SMT）對肝前性門脈高壓大鼠食管靜脈曲張的影響，以探討iNOS在食管靜脈曲張發生中的作用，以及使用iNOS抑制劑SMT治療食管靜脈曲張的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠60只，體重220～250g，由河北醫科大學實驗動物中心提供［SCXK（冀）2008-1-003］；S-甲基異硫脲（S-methyl isothiourea，SMT）購自美國Sigma公司；一氧化氮合酶測定試劑盒（分型）、一氧化氮試劑盒（硝酸還原法）購自南京建成生物工程研究所；CD34免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物科技公司。上海光譜儀器有限公司產SP721E型分光光度計，MiaS-2000型圖像分析儀，歐林巴斯BX51光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物造模和分組：大鼠隨機分為5組：①假手術組（n=12）：僅分離門靜脈主干和左側腎上腺靜脈，不結扎，余步驟同模型組；②模型組（n=12）：采用尹朝暉等介紹的方法門靜脈兩步法結扎加左腎上腺靜脈結扎制備大鼠門脈高壓食管靜脈曲張模型［5］，手術24h后，每日給予腹腔注射生理鹽水0.5mL/100g一次，共20日；③低劑量SMT干預組（n=12）：手術同模型組，手術24h后，每日給予腹腔注射濃度為5mg/mL的SMT溶液，0.5mL/100g一次，共20日；④中劑量SMT干預組（n=12）：手術同模型組，手術24h后，每日給予腹腔注射濃度為10mg/mL的SMT，0.5mL/100g一次，共20日；⑤高劑量SMT干預組（n=12）：手術同模型組，手術24h后，每日給予腹腔注射濃度為20mg/mL的SMT，0.5mL/100g一次，共20日。

1.2.2 門脈壓力測定：大鼠術后21d，腹正中線開腹，經回盲靜脈插入一根充滿生理鹽水的硬膜外導管至門靜脈，提起硬膜外導管遠端，以鼠右心房水平為“0”點。測門靜脈壓力。

1.2.3 門脈取血、組織石蠟切片HE染色：門靜脈采血3mL，離心機2000r/min，離心20min，取血清放入液氮罐凍存待測。取食管與胃交界處以上0.5cm的食管標本，置入福爾馬林溶液中固定，常規石蠟包埋，同一標本兩份5μm橫截面切片，一份切片行常規HE染色。

1.2.4 利用血管內皮細胞表面特異表達CD34原理免疫組化SP法標記血管內皮：另一份切片在67℃烤箱中烤20min，放入二甲苯中脫蠟至水、采用熱修復30min，一抗為兔抗鼠CD34IgG抗體凍干粉，稀釋為100μL的濃縮液-20℃存放。濃縮液用PBS×1稀釋為1∶150，盡量現配現用，二抗為生物素標記的羊抗兔IgG抗體，37℃孵育30min效果好，DAB顯色2min左右，顯微鏡下觀察適時終止，其余步驟按說明書依次操作，蘇木精復染，脫水透明封片。

1.2.5 測定門脈血中TNOS活性、iNOS活性和NO濃度：按要求將試劑盒中的試劑配好，從液氮罐中取出血清放入4℃冰箱融化，其余步驟按說明書操作。分光光度計蒸餾水調零，TNOS活性與iNOS活性在530nm處，1cm光徑，測各管的吸光度值；NO濃度在550nm，0.5cm光徑，測各管的吸光度值，計算測定結果。

1.2.6 圖像分析：在光學顯微鏡下觀察HE染色食管黏膜、黏膜下層、肌層以及漿膜各層的改變。圖像分析儀分析食管免疫組化結果：（l）黏膜下直徑大于20μm血管的數目；（2）黏膜下直徑大于20μm血管的總截面積；（3）黏膜下直徑大于20μm單一血管的平均截面積即黏膜下血管總截面積與黏膜下血管數目比值。

1.2.7 統計學處理：應用SPSS11.5統計軟件進行數據分析，結果采用均數±標準差（±s）表示，數據行正態性檢驗，組間行方差齊性檢驗，滿足條件采用單因素方差分析，不滿足則采用Kruskal-Wallis檢驗，組間差異均采用Bonferroni法分析進行兩兩比較。

2 結果

二次完全阻斷門脈后存活大鼠，假手術組11只、模型組6只、低劑量組6只、中劑量組7只、高劑量組6只。

2.1 門脈壓力，組織HE染色切片

假手術組大鼠門脈壓力（11.45±2.1）cm H2O，模型組大鼠的門脈壓力為（22.43±2.44）cm H2O，低劑量組大鼠（18±3.37）cm H2O，中劑量組（17.6±2.54）cm H2O，高劑量組（17.44±2.94）cm H2O，模型組大鼠的門脈壓力顯著高于用藥各組（P≤0.01），但是用藥各組的門脈壓力依然高于門脈高壓的診斷標準16cm H2O［6］。組織切片可見模型組黏膜下靜脈和食管漿膜外經脈嚴重迂曲擴張，數量增加，靜脈橫截面積增大，部分極度擴張的黏膜下靜脈向食管腔內隆起，低劑量組與模型組類似癥狀略有減輕，中劑量與高劑量組食管曲張不明顯（圖1，彩插6）。

2.2 門脈血中TNOS、iNOS的活性、NO的含量

TNOS的活性統計結果表明模型組顯著高于其他各組（P＜0.01）；低劑量組明顯高于剩余3組（P≤0.01）；假、中與高三組之間差異不顯著。iNOS的活性統計結果表明模型組顯著高于假、中和高三組（P＜0.005），假、中和高三組之間差異不顯著。NO的濃度統計結果表明模型組與低劑量組顯著高于其他三組（P＜0.01），模型組與低劑量組差異不顯著，假，中和高三組之間差異不顯著（表1）。

表1 門脈血TNOS、iNOS的活性和NO的含量Tab.1 TNOS activity，iNOS activity，NO content in portal blood

2.3 免疫組化CD34標記食管血管內皮，圖像分析

血管數目統計結果表明模型組與低劑量組顯著多于其他各組（P＜0.01），模型組和低劑量組差異不顯著，假、中與高三組之間差異不顯著。血管平均截面積統計結果表明模型組顯著大于其他各組（P＜0.01）；低劑量時已經出現一定改善作用，但仍高于除對照外的其他各組（P＜0.01）；假、中與高三組之間差異不顯著。血管總面積統計結果表明模型組顯著大于假、中和高三組（P＜0.005）；假、中與高三組之間差異不顯著，可見低劑量組已經在血管總面積表現出一定的改善作用（表2）。

3 討論

本研究顯示造模大鼠給予不同濃度SMT后，中劑量組與高劑量組大鼠門脈血TNOS、iNOS的活性以及NO的濃度較模型組明顯下降，食管黏膜下血管的數目、單一血管的平均截面積及血管總面積等食管靜脈曲張癥狀比模型組明顯減輕。實驗結果顯示SMT可以降低門脈高壓癥食管靜脈曲張大鼠的NO濃度，改善大鼠門脈高壓食管靜脈曲張狀況。在本研究中我們同時觀察到中、高劑量組門脈血中NO濃度與假手術組差異不顯著，表明在門脈高壓食管靜脈曲張病中高水平的NO主要產生自iNOS，SMT在抑制門脈血中高水平的NO方面，可以取得與非選擇性的一氧化氮合酶抑制劑同等的效果。

表2 食管黏膜下血管的數目，平均截面積和總面積Tab.2 The number，the average cross-sectional area，total area of esophageal submucosal blood vessels

分析本實驗結果我們認為S MT作用機制可能為，門脈高壓時由于腸黏膜屏障的損壞，門體靜脈側支循環的形成和門體分流異常，腸源性的內毒素與IL-1、TFNα等炎癥因子大量進入體循環，導致內毒素血癥的發生。內毒素與IL-1、TFNα等炎癥因子能刺激iNOS基因轉錄、表達、合成和釋放大量NO［7］。NO具有強大的舒血管特性，同時還介導門脈高壓內臟血管對內源性縮血管物質的低敏感性［8］，以及能使血管括約肌舒張引起血液淤滯等因素共同促進了食管靜脈曲張的發生和演繹。而正是由于SMT能夠抑制iNOS合成非生理濃度的大量NO，降低NO的水平從而緩解了門脈高壓食管靜脈曲張病程進展。

在實驗中我們也發現SMT并不能將門脈壓力降到診斷標準以下，這與張丕利等的研究結果一致［9］。資料顯示在各種液遞物質之間存在一種平衡，當NO減少時其他血管活性物質會相對的增加以保持壓力的相對平衡。

非選擇性的一氧化氮合酶抑制劑對大鼠食管靜脈曲張具有一定保護作用［2］，但該方法用于臨床治療有許多理論上難以解決的問題。非選擇性的一氧化氮合酶抑制劑的非特異作用可能對機體生理調節所必須的NO產生干擾，如以L-NAME抑制內源性NO合成可明顯增強胃黏膜對損傷因子的易感性［10］。而從理論上選擇性的iNOS抑制劑則可避免這種干擾，我們的實驗證明SMT同樣對大鼠食管靜脈曲張具有一定保護作用。當然選擇性的iNOS抑制劑用于臨床仍然也有許多問題尚待進一步探討，如用藥組的生存率在本實驗中并無提高以及高劑量組大鼠腹腔出現膿毒癥等現象。但不管怎樣，本研究結果為今后選擇性iNOS抑制劑類藥物應用于臨床提供了重要的實驗依據。

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