低硒小鼠模型的建立及低硒對(duì)心肌的影響

張 琦，張中海，鐘照華，朱孝榮

（1.徐州醫(yī)學(xué)院，徐州 221004；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，哈爾濱 150081）

克山?。↘eshan disease，KSD）是一種原因不明的地方性心肌病，因發(fā)現(xiàn)于黑龍江省克山縣而得名，目前認(rèn)為其病因中有很重要的一條就是飲食中微量元素硒的缺乏［3］。低硒是個(gè)普遍關(guān)注的問題，全球許多地區(qū)的癌癥死亡率與血硒濃度呈負(fù)相關(guān)，人體血硒含量長(zhǎng)期低于0.1ppm可引起肝壞死、心肌損害、癌癥和關(guān)節(jié)炎等疾?。?～7］。

但是到目前為止，低硒如何影響心肌細(xì)胞并導(dǎo)致心肌病的確切機(jī)制仍不清楚［8］，除了流行病學(xué)證據(jù)外，我們還無法從細(xì)胞和分子生物學(xué)角度清晰地認(rèn)識(shí)低硒與克山病發(fā)生的關(guān)系。多數(shù)關(guān)于低硒的研究集中在含硒蛋白在氧化應(yīng)急調(diào)節(jié)、抗腫瘤等領(lǐng)域。

為了進(jìn)一步研究低硒導(dǎo)致心肌病的具體機(jī)制，建立低硒的動(dòng)物模型是非常必要的，本課題組嘗試用克山病高發(fā)地區(qū)-黑龍江省的地產(chǎn)酵母制作低硒飼料，以建立低硒鼠的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3周齡BALB/c鼠，購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（蘇）2005-0005］。

1.1.2 低硒飼料及其配制方法：酵母（Torula yeast）購(gòu)自哈爾濱馬利酵母廠。混合維生素（vitamin mix）與甲硫氨酸（DL-methionine）購(gòu)自GIBCO公司。玉米油（corn oil）購(gòu)自大潤(rùn)發(fā)超市。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；低硒飼料根據(jù)美國(guó)Harlan Teklad公司的TD 92163產(chǎn)品配方進(jìn)行配制，配方為（g/kg）：Torula yeast 300.0g、DL-methionine 3.0g、sucrose 591.0g、corn oil 50.0g、mineral mix 35.0g、CaCO311.0g、vitamin mix 10.0g。

1.1.3 普通飼料及其配制方法：使用小麥等代替低硒飼料中的酵母（Torula yeast）和蔗糖；配方為（g/kg）：小麥530.0g、大麥182.5g、全脂乳粉50.0g、脫脂奶粉50.0g、魚粉30.0g、骨粉30.0g、鹽（含碘）8.5g、魚肝油10.0g。

首先，福建省僅有一所招收聾人大學(xué)生的高等院校，且辦學(xué)層次為?？?，這與八、九十年代就開始招收聾人大學(xué)生的長(zhǎng)春大學(xué)、天津理工大學(xué)、鄭州工程技術(shù)學(xué)院等本科院校相比，發(fā)展遲、經(jīng)驗(yàn)少、規(guī)模小、辦學(xué)層次低。其次，福建省僅招收兩個(gè)聽障專業(yè)，雖然這兩個(gè)專業(yè)符合聾人的特點(diǎn)和需求，但是專業(yè)面窄、可選擇少，且全國(guó)20多所招收聾人大學(xué)生的其他院?；旧弦捕加羞@兩個(gè)專業(yè)，專業(yè)的重復(fù)建設(shè)使得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)不大且市場(chǎng)需求趨于飽和。由于缺乏經(jīng)驗(yàn)，學(xué)校仍以管理健聽生的方式來管理和要求系部，系部管理人員及教師等被大量的事務(wù)性工作所累，疲于應(yīng)對(duì)各種建設(shè)、檢查等，缺乏精力專心、深入地研究聾人教育事業(yè)。

1.2 方法

1.2.1 低硒小鼠模型的建立：純系BALB/c乳鼠（雌雄各半）購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。共分5組，每組15只小鼠。兩組低硒組，一組對(duì)照組，這三組雌雄分籠，實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物的活動(dòng)狀況、飲食與體型變化，從第16周開始每周對(duì)老鼠進(jìn)行稱重并記錄。其余兩組分別為繁育對(duì)照組和繁育低硒組，均雌雄合籠，觀察小鼠的繁殖次數(shù)。對(duì)照組和繁育對(duì)照組均使用普通飼料喂養(yǎng)；低硒組和繁育低硒組，使用低硒飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前小鼠均先使用普通飼料喂養(yǎng)適應(yīng)3d，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食，飲用水為ddH2O。

1.2.2 硒水平的測(cè)定：在第18周，取低硒組和對(duì)照組的Balb/c鼠各一只，從眼眶取血處死并且正常解剖取心臟和肝臟，由農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心按GB/T 5009.93-2003方法（原子熒光分光光度計(jì)）檢驗(yàn)測(cè)定血、肝臟和心臟中的硒水平。

1.2.3 心肌酶的測(cè)定：在第22周，從低硒組和對(duì)照組各選5只BALB/c鼠眼球取血，分離血清，使用日立7600型生化自動(dòng)分析儀來測(cè)定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶MB型同工酶（CK-MB）、α-羥丁酸脫氫酶（HBDH）等心肌酶的水平，數(shù)據(jù)用student’s t test分析組間差異性。

1.2.4 心肌組織的結(jié)構(gòu)觀察：第20周，將低硒組和對(duì)照組的小鼠斷頸處死，取心臟組織，一部分常規(guī)制片觀察心肌的病理變化，另一部分戊二醛固定，超薄切片，透射電鏡觀察心肌組織的超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 飼料中硒水平的測(cè)定

配制的飼料經(jīng)農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心按GB/T 5009.93-2003方法檢驗(yàn)，結(jié)果含硒量0.016mg/kg（即0.016ppm），符合低硒實(shí)驗(yàn)研究要求。

2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠一般狀況觀察

2.2.1 行為和狀態(tài)：低硒飼料喂養(yǎng)16周后，每日觀察BALB/c鼠行為活動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)育的情況。低硒組小鼠表現(xiàn)活動(dòng)度明顯增強(qiáng)，對(duì)外界刺激敏感，毛色不順。與對(duì)照組的BALB/c鼠相比發(fā)育減緩，體重增長(zhǎng)速度明顯降低。生育能力主要觀察小鼠的繁殖次數(shù)，在四個(gè)月的飼養(yǎng)過程中，繁育低硒組沒有繁殖，而繁育對(duì)照組繁殖4次。

2.2.2 體重：從第16周開始每周對(duì)低硒組和對(duì)照組的BALB/c鼠稱重一次，根據(jù)稱重的結(jié)果繪制BALB/c鼠的生長(zhǎng)曲線圖。結(jié)果可以看出，低硒組BALB/c鼠的體重增長(zhǎng)呈停滯狀態(tài)，并且出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng)，而對(duì)照組呈正常增長(zhǎng)的趨勢(shì)，兩組小鼠體重變化顯著（P＜0.05）（圖1）。

圖1 低硒鼠的體重曲線Fig.1 The body weight changes of mice fed with seleniumdeficient diet

2.3 動(dòng)物硒水平的測(cè)定

對(duì)照組鼠肝臟、心臟與血液中的硒水平分別為0.763mg/kg、0.274mg/kg、0.316mg/kg。低硒組的鼠肝臟、心臟和血液中的硒含量則為0.219mg/kg、0.187mg/kg、0.241mg/kg。低硒飼養(yǎng)的動(dòng)物肝臟、心臟和血液中的硒水平都達(dá)到了低硒的標(biāo)準(zhǔn)，其中心臟中的硒水平達(dá)到了硒缺乏的程度。低硒飼養(yǎng)后肝臟硒水平下降幅度巨大。

2.4 心肌酶測(cè)定結(jié)果

在第22周從5只低硒組和5只對(duì)照組的BALB/c鼠眼球取血，分離血清，檢測(cè)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶MB型同工酶（CK-MB）、α-羥丁酸脫氫酶（HBDH）心肌酶的水平。結(jié)果可以看出，低硒組AST、LDH、CK、HBDH等酶均較對(duì)照組高，但是CKMB與對(duì)照組持平，具體原因有待進(jìn)一步研究證實(shí)，說明在低硒條件下，心肌酶的變化不明顯（圖2）（P＞0.05）。

2.5 心肌組織結(jié)構(gòu)觀察（圖3，4見彩插8）

光鏡下觀察低硒鼠與正常鼠心肌組織的變化（圖3）。對(duì)照組小鼠心肌組織可見局灶性心肌細(xì)胞變性、溶解，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列整齊，呈短圓柱狀，心肌纖維之間有薄層結(jié)締組織，胞核呈圓形或梭形，位于細(xì)胞中央；低硒組小鼠心肌組織也可見局灶性心肌細(xì)胞變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病變多呈灶狀分布，偶見片狀，心肌間質(zhì)充血、水腫，心肌細(xì)胞空泡變，心肌纖維間疏松化，肌纖維走形呈波浪狀。透射電鏡觀察低硒組與對(duì)照組心肌組織的超微結(jié)構(gòu)變化（圖4）。對(duì)照組心肌組織可見，心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞核核型輕度不整，肌節(jié)各帶結(jié)構(gòu)清晰，線粒體豐富、膜結(jié)構(gòu)清晰，肌漿網(wǎng)輕度擴(kuò)張，閏盤橋粒和縫隙連接及中間連接結(jié)構(gòu)均好，間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，腔適中；低硒組心肌組織顯示，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，但是各帶結(jié)構(gòu)不完整，部分肌絲溶解形成條索狀或管泡狀，閏盤連接結(jié)構(gòu)斷裂或融合，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯異型性，移位于質(zhì)膜下，核周線粒體數(shù)量明顯增多，線粒體嵴呈絮狀變，線粒體間可見大量溶酶體出現(xiàn)，肌漿網(wǎng)彌漫性擴(kuò)張。

圖2 低硒鼠與正常鼠心肌酶測(cè)定結(jié)果Fig.2 Myocardial enzymatic examinations of mice fed with selenium-deficient diet

3 討論

本研究通過建立硒缺乏小鼠模型，進(jìn)而研究低硒對(duì)心肌的影響。我們根據(jù)美國(guó)Harlan Teklad公司的TD 92163產(chǎn)品配方，利用產(chǎn)于黑龍江的Torula酵母，加混合維生素、甲硫氨酸（DL-methionine）、玉米油及混合無機(jī)鹽，配制了低硒飼料，經(jīng)農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心按GB/T 5009.93-2003方法檢驗(yàn)，結(jié)果含硒量0.016mg/kg，符合低硒飼料標(biāo)準(zhǔn)要求。

經(jīng)低硒飼料飼養(yǎng)18周的BALB/c鼠，取肝臟、心臟和血清檢測(cè)硒含量，結(jié)果為0.219mg/kg、0.187mg/kg、0.241mg/kg，均達(dá)到了低硒診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中心臟的硒水平達(dá)到了硒缺乏的程度。

低硒飼養(yǎng)過程中，Balb/c小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育受到了明顯的影響，動(dòng)物毛發(fā)混亂，體重增長(zhǎng)減緩，對(duì)外界刺激敏感。

在動(dòng)物機(jī)體中存在與正常繁殖力有關(guān)的硒蛋白是精子被膜硒蛋白［8.9］，是構(gòu)成精子細(xì)胞囊以及精子尾部中段的主要成份，對(duì)其結(jié)構(gòu)功能起重要作用，在低硒的條件下會(huì)造成動(dòng)物繁殖力低下。本研究中，繁育低硒組小鼠在4個(gè)月飼養(yǎng)期間沒有繁殖，而繁育對(duì)照組小鼠繁殖4次，推測(cè)與此有關(guān)［10.11］。

線粒體是細(xì)胞的能量代謝場(chǎng)所，線粒體的改變會(huì)導(dǎo)致心肌組織能量代謝障礙。本研究的超微結(jié)構(gòu)觀察可見，在低硒條件下心肌組織中發(fā)生了一些結(jié)構(gòu)變化，特別是線粒體出現(xiàn)病理變化，線粒體嵴呈絮狀改變。此結(jié)果與克山病的病理特點(diǎn)相符。但是在光鏡下觀察，未見到明顯的病理改變。說明在低硒的條件下，雖然超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但是不會(huì)出現(xiàn)明顯的病理改變。

我們還檢測(cè)了低硒飼養(yǎng)小鼠血清中的心肌相關(guān)的酶水平，結(jié)果AST、LDH、CK、HBDH等酶均較常硒養(yǎng)鼠高，CK-MB與常硒鼠持平，但與常硒鼠比較，這些變化沒有顯著差異。提示短期的低硒飼養(yǎng)已經(jīng)造成了小鼠的輕度心肌損傷。

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