尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶的研究現(xiàn)狀

歐光武，李 威

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東汕頭 515041）

蛇毒類(lèi)凝血酶(thrombin like enzyme，TLE)是蛇毒中與血漿凝血酶性質(zhì)相似的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，通常具有精氨酸酯酶活性。它的重要特性是可水解血纖蛋白原為血纖蛋白，但不能激活體內(nèi)各種凝血因子，具有抗凝、溶栓、去纖、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等多種功效。蛇毒類(lèi)凝血酶的研究，國(guó)外開(kāi)展得比較早，已從多種蝮亞科蛇毒中提取出蛇毒類(lèi)凝血酶。瑞士產(chǎn)止血?jiǎng)㏑eptilase就是從巴西矛頭蝮蛇毒中提取出的類(lèi)凝血酶，國(guó)內(nèi)外已廣泛用于出血性疾病及手術(shù)前后出血的臨床防治。

我國(guó)正在研究的一種國(guó)產(chǎn)新藥——注射用尖吻蝮蛇凝血酶具有良好的止血效果。對(duì)尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等，他們于1971年和1972年相繼分離出兩個(gè)類(lèi)凝血酶組分，并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均有不同程度抗凝作用，與國(guó)內(nèi)溶栓藥降纖酶相同。1984年中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所張洪基等[1]分離得到含有4個(gè)同工酶的多組分TLE，但無(wú)法獲得純品。1993～2005年，唐松山等經(jīng)12年的努力，從尖吻蝮蛇蛇毒中獲得了5個(gè)新的類(lèi)凝血酶，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的研究。2003年開(kāi)始該類(lèi)凝血酶進(jìn)入臨床試驗(yàn)，并取得了良好的臨床止血效果[2-3]。2009年從我國(guó)內(nèi)地特有的尖吻蝮蛇蛇毒中提取開(kāi)發(fā)的國(guó)家一類(lèi)新藥“蘇靈”已經(jīng)上市。

以下對(duì)有關(guān)尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶的理化特性、制備、作用機(jī)制、臨床應(yīng)用等方面的研究資料進(jìn)行總結(jié)：

1 尖吻蝮蛇凝血酶的理化特性

尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶是我國(guó)開(kāi)發(fā)的一種新藥，目前正處于研發(fā)、實(shí)驗(yàn)階段，國(guó)內(nèi)雖有多個(gè)研究中心對(duì)其進(jìn)行研究，但其理化特性尚未完善。關(guān)于尖吻蛇毒類(lèi)凝血酶的研究主要集中在以下兩種：

1.1 雙亞基結(jié)構(gòu)的血凝酶

從尖吻蝮蛇毒中分離純化的雙亞基結(jié)構(gòu)的血凝酶，目前國(guó)內(nèi)的研究主要集中在此具有雙亞基結(jié)構(gòu)的凝血酶上。普遍認(rèn)為尖吻蝮蛇凝血酶主要有效成分為4個(gè)具有相同功能的凝血酶樣酶，該4個(gè)同工酶與以往蛇毒類(lèi)凝血酶的結(jié)構(gòu)完全不同，均為雙鏈結(jié)構(gòu)。由于尖吻蝮蛇蛇毒中的許多分子量、等電點(diǎn)和凝結(jié)活性相近的蛇毒蛋白長(zhǎng)時(shí)間地影響了純化工藝，所以每個(gè)研究中心對(duì)蛇毒提出的成分或者純度不一樣，其研究結(jié)果尚未能完全統(tǒng)一。分述如下：

1.1.1 2002年，唐松山等從尖吻蝮蛇蛇毒中提純得到一種具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶，用SDS-PAGE法測(cè)得其全分子量為32 kD，由相近兩個(gè)亞基組成，亞基分子量17 kD和15 kD，該酶最適溫度為35℃，最適pH=7.5，等電點(diǎn)為5.9。用酸水解測(cè)得該酶由18或20種氨基酸組成，各氨基酸組成為（%）：Asp 為 6.2，Thr為 1.43，Ser為 4.16，Glu 為8.74，Gly 為 2.14，Ala 為 2.15，Val為 2.88，Met為 1.33，I1e 為2.35，Leu 為 2.28，Tyr為 2.45，Phe 為 4.16，Lys為 4.19，His為1.58，Arg 為 1.83，Pro 為 1.8，Cys為 4.34，Trp 為 4.93，NH 為32.68。

1.1.2 2005年，唐松山等再次從尖吻蝮蛇毒中提純類(lèi)凝血酶，其等電點(diǎn)為5.51～5.64。該凝血酶分子量為29.3～29.5 kD，由分子量分別為15.0 kD和14.2 kD的亞基A、B以二硫鍵連接而成，含204個(gè)氨基酸。其A亞基N端第1～25位的氨基酸序列為DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亞基N端第1～25位的氨基酸序列為DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。

1.1.3 2005年，張艷宇等對(duì)尖吻蝮蛇凝血酶的進(jìn)行克隆分析，推測(cè)尖吻蝮蛇凝血酶分子量為26 429，由263個(gè)氨基酸組成，理論上的等電點(diǎn)為7.6，其信號(hào)肽序列為1～24個(gè)氨基酸殘基， 成熟肽序列中有 12 個(gè) Cys31、52、68、102、144、165、176、191、202、212、226、258 殘基，形成 6 個(gè)二硫鍵，符合 TLE的典型特征；也含有TLE的催化活性中心的保守性氨基酸殘基His67、Asp112、Asp200和ser206，其成熟肽N端氨基酸為Val25，這和大多數(shù)的TLE是相同的[4]。

1.1.4 2009年，唐松山等對(duì)尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶Agacutin的亞基進(jìn)行拆分和氨基酸殘基測(cè)序，證明了Agacutin是一個(gè)15 kD和16 kD亞基組成的異二聚體。大亞基N端15個(gè)氨基酸殘基序列為DCSSGWSSYEEHQYY和小亞基序列DSSGWSSYEGHEYYV[5]。

1.2 單鏈糖蛋白

1.2.1 2005年翟寧等[6]從皖南尖吻蝮蛇毒中分離純化得到一種絲氨酸蛋白酶，該酶分子量為68 kD，但該酶的等電點(diǎn)、pH值結(jié)構(gòu)、氨基酸序列及結(jié)構(gòu)等，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

1.2.2 2008年，成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心軍事醫(yī)學(xué)研究所鄭穎等[7]從尖吻蝮蛇蛇毒中分離得到單鏈血凝酶，等電點(diǎn)為6.59，其N(xiāo)末端氨基酸序列為VIGGNECDTNEEHFL，與巴西矛頭蝮蛇毒來(lái)源的血凝酶N末端VIGGDECDINEHPFLA有5個(gè)氨基酸不同，具有較高同源性。因而在結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)上與藥品血凝酶注射液中的巴曲酶很相似。

2 尖吻蝮蛇凝血酶的制備

從天然蛇毒中提取的類(lèi)凝血酶絕大多數(shù)為酸性蛋白質(zhì)，多采用陰離子交換柱進(jìn)行分離，并結(jié)合凝膠過(guò)濾、親和層析和反相液相色譜等方法純化[8]。常用的陰離子交換劑：DEAE-葡聚糖凝膠、DEAE-纖維素等。葡聚糖凝膠多用G-100、G75作分離。基于蛋白質(zhì)的疏水性，采用非極性烷基固定相作為填料，采用反相液相色譜可以使類(lèi)凝血酶有較高的回收率。親和層析主要運(yùn)用的是酶與競(jìng)爭(zhēng)劑特異性相互作用的原理。尖吻蝮蛇凝血酶作為類(lèi)凝血酶中的一種，目前對(duì)該蛇毒凝血酶的提純及制備仍主要采用該方法[6]。

從蛇毒毒液中分離純化類(lèi)凝血酶數(shù)量有限，并且常因純度難以控制而導(dǎo)致其他免疫毒副反應(yīng)。基于對(duì)經(jīng)濟(jì)蛇種功能蛋白資源的保護(hù)以及解析類(lèi)凝血酶結(jié)構(gòu)和功能的需要，利用基因工程手段制備大量高純類(lèi)凝血酶就顯得尤為迫切。2005年，張艷宇等[4]從尖吻蝮蛇毒腺總RNA中通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，獲得1個(gè)類(lèi)凝血酶基因，該蛇毒類(lèi)凝血酶基因的獲得為其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

3 尖吻蝮蛇凝血酶的作用機(jī)制

人血漿纖維蛋白原由3對(duì)不同的肽鏈即α、β、γ組成，每條α鏈上包含1個(gè)A肽，β鏈上包含1個(gè)B肽，故纖維蛋白原可寫(xiě)成[αAβBγ]2。在凝血酶作用下，纖維蛋白原釋放出2條A肽和2條B肽，成為纖維蛋白單體(αβγ)2，后者聚合成可溶性多聚體。凝血酶同時(shí)激活凝血因子(纖維蛋白穩(wěn)定因子)促使纖維蛋白分子間形成共價(jià)鍵，以二聚體和多聚體方式交聯(lián)，成為穩(wěn)定的、不溶的纖維蛋白多聚體。蛇毒類(lèi)凝血酶的作用機(jī)制與凝血酶完全不同，部分蛇毒類(lèi)凝血酶僅裂解α亞基的A肽，使纖維蛋白原成為(αBβγ)2；部分蛇毒類(lèi)凝血酶僅裂解β亞基B肽，使纖維蛋白原裂解成(Aαβγ)2[9]。尖吻蝮蛇凝血酶使纖維蛋白原α亞基裂解出A肽后，產(chǎn)生纖維蛋白單體(αBβγ)2，釋放FPB，從而促進(jìn)纖維蛋白單體的形成及聚合[10]。在聚合過(guò)程中，由于尖吻蝮蛇凝血酶不誘導(dǎo)凝血酶Ⅷ因子的釋放[11]，生成的纖維蛋白單體只能首尾聚合，而不能縱向聚合，這樣形成的聚合體不牢固，生成的纖維蛋白為可溶性的非交聯(lián)單體，很快會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬和循環(huán)血液清除，因此在體內(nèi)表現(xiàn)抗凝和溶纖功能[11]，同時(shí)類(lèi)凝血酶對(duì)血小板的聚集不起作用，機(jī)體仍能保持正常的止血功能；在體外則表現(xiàn)出促凝效果。

凝血酶分子對(duì)纖維蛋白原的識(shí)別依賴(lài)于其外識(shí)別位點(diǎn)（fibrinogen recognition exosite，F(xiàn)RE），肝素是 FRE 依賴(lài)型抑制劑，可以完全抑制凝血酶活力，但尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶促凝作用不受肝素和AT-Ⅱ的抑制[12]，這與文獻(xiàn)報(bào)道的肝素治療濃度不抑制蛇毒凝血酶體內(nèi)體外促凝活性的結(jié)論一致。

4 尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶的應(yīng)用

尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶具有的生理特性表現(xiàn)為在體外其可作為促凝劑將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，而在體內(nèi)它們導(dǎo)致良性的降纖效應(yīng)。這就決定了尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶在未來(lái)的臨床應(yīng)用中將主要用于止血、抗血栓兩方面，該凝血酶在這兩方面的作用有劑量依賴(lài)性，在小劑量時(shí)顯示凝血活性，其大劑量則體現(xiàn)抗凝活性。

4.1 止血作用

目前多項(xiàng)研究表明尖吻蝮蛇凝血酶具有較好的促進(jìn)全血凝固和止血作用[13-14]。該類(lèi)凝血酶在血管內(nèi)只產(chǎn)生纖維蛋白B單體，同時(shí)只促進(jìn)出血部位血小板聚集，而對(duì)正常血管系統(tǒng)內(nèi)無(wú)血小板聚集作用，因此人體凝血酶僅在出血部位形成，而正常血管內(nèi)不會(huì)存在凝血酶，也不會(huì)有纖維蛋白A、B單體。尖吻蝮蛇凝血酶是一種安全有效的新型止血藥[15]，不會(huì)引起正常血管內(nèi)血栓，可以體內(nèi)給藥用于出血和出血性疾病的預(yù)防和治療。

4.2 抗血栓作用

尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶清除纖維蛋白的前體，可以有效預(yù)防前者而控制血栓的發(fā)展，并增強(qiáng)纖溶作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶能明顯延長(zhǎng)CT、APTr、PT、TT，降低纖維蛋白原含量[16]，具有很好的抗凝和溶栓的效應(yīng)[17]。1995年，李志忠等[12]從尖吻蝮蛇毒分離提純出單一成分，從而擺脫了之前該類(lèi)凝血酶體內(nèi)應(yīng)用的出血毒副反應(yīng)，使得尖吻蝮蛇毒在抗凝方面具有很好的開(kāi)發(fā)前景。

5 尖吻蝮蛇凝血酶研究的展望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)手段的快速發(fā)展，蛇毒類(lèi)凝血酶的研究已經(jīng)由蛋白質(zhì)水平向分子水平轉(zhuǎn)變。尖吻蝮蛇凝血酶在未來(lái)的研究中仍需攻克各種難關(guān)，然而研究主要問(wèn)題又將向以下兩個(gè)方面集中：①有關(guān)天然蛇毒的來(lái)源問(wèn)題，很多蛇種都是國(guó)家保護(hù)品種，尖吻蝮蛇作為自然生物雖然在很多地區(qū)均存在，無(wú)止境的捕殺利用終有使其滅跡的日子。因此，要充分利用基因工程的方法生產(chǎn)尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶，這將使天然蛇毒資源和產(chǎn)品純度的問(wèn)題得到解決，并且要在以后的蛇毒研究中改進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)解決產(chǎn)物蛋白復(fù)性、后修飾及對(duì)宿主的毒性問(wèn)題，這將對(duì)提高表達(dá)量和生物活性有重要意義[18-19]。②目前對(duì)于尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶的結(jié)構(gòu)研究主要集中在一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，對(duì)于高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究還很欠缺，對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析將成為未來(lái)研究重點(diǎn)。迄今為止，已分別得到的蛇毒類(lèi)凝血酶有 acuthrombin B、jaramcussin、bothrombin和另外兩種蛇毒絲氨酸蛋白酶結(jié)晶[20]。筆者希望能以此為基礎(chǔ)盡快獲得尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶的晶體，如果能得到該凝血酶純品并結(jié)晶出來(lái)，將可以利用晶體學(xué)等手段研究生物大分子的結(jié)構(gòu)，從而從分子生物學(xué)的角度闡明其活性中心構(gòu)造和酶催化機(jī)制。

尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶作為具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)新藥，目前對(duì)于該凝血酶性質(zhì)、功能、臨床應(yīng)用等正在深入的研究，可以預(yù)見(jiàn)尖吻蝮蛇毒類(lèi)凝血酶將會(huì)填補(bǔ)國(guó)產(chǎn)類(lèi)凝血酶的空白，為臨床用藥提供更多的選擇，況且已有研究表明，該凝血酶總體的藥效和毒性都優(yōu)于血凝酶注射液，不失為血凝酶注射液的潛在取代品。

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