不同功效中藥誘導間充質干細胞定向分化的研究概況

戴 映,楊萬章,金明月

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有分化成間質起源的任意組織的潛能,包括向神經元樣細胞、軟骨、脂肪、造血基質及骨等分化成熟的特征[1,2]。MSCs不僅存在于骨髓中,也可從臍血、外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離,也有人從臍帶靜脈內皮下層分離出MSCs[3]。由于MSCs向神經細胞等多種細胞分化的特性及其特有的免疫調節特性[4,5],故而成為目前研究的熱點,使其作為最佳種子細胞在組織工程中令人看好。人們把間充質干細胞可以跨系,甚至跨胚層分化這一特性稱為干細胞的可塑性(p lasticity),也稱為橫向分化(transdifferentiation)[6]。利用這一特性在體外大量誘導分化成神經細胞后,可作為治療神經系統損傷疾病的種子細胞來源。中醫藥學對神經功能缺損疾病的治療也有著比較深刻的認識和豐富的經驗,近年研究表明,中藥不僅可以保護神經細胞,提高神經元抵抗損傷的能力,而且還可以促進MSCs增殖并誘導其定向分化為神經元樣細胞,達到治療神經功能缺損疾病的目的。現依據不同功效的中藥對間充質干細胞定向誘導為神經元樣細胞的思路,將近幾年有關的實驗研究情況簡單的綜述如下。

1 補中益氣藥誘導間充質干細胞分化

中國傳統中藥的應用歷史源遠流長,黃芪、人參等更是臨床應用較多的中藥。黃芪、人參益氣活血、抗氧化、延緩衰老、增強機體免疫功能等作用,實驗同樣證明對正常大鼠的學習、記憶過程有促進作用。賈延劼[7]首次采用黃芩苷誘導大鼠MCS(rMSC)在體外分化成為神經細胞,多數細胞表達神經元烯醇化酶(NSE)、神經絲蛋白(NF),黃芩苷與巰基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)相比,雖然在早期誘導效果不如β-ME,但是長期效果優于β-ME,且細胞存活率較高。劉金寶等[8-10]采用多種單味中藥(當歸、人參、天麻、黃芪等)誘導rMSC,1 h～3 h后,其中大部分rMSC分化為神經元樣細胞,其轉化率分別為當歸(74.2±3.8)%、人參(69.3±4.1)%、天麻(75.3±4.1)%、黃芪(93.7±2.3)%。姚曉黎等[11]報道參芪液(含黨參和黃芪)可在體外誘導人MCS(hM SC)分化為神經元樣細胞。參芪液具有補中益氣、生津養血的功效,可以促進正常機體生長,有抗氧化、增強免疫和抑制細菌的作用。

2 補腎填精藥誘導間充質干細胞分化

劉柏炎等[12]認為干細胞可歸于中醫正氣范疇,胚胎干細胞與先天之精氣有關。中醫學的“精”在內涵上與干細胞有很大的相關性,干細胞具先天之精屬性,是先天之精在細胞層次的存在形式。腎藏精,精生髓,腦為髓之海。根據干細胞具先天之精屬性理論及精生髓通腦理論,張進等[13]認為,來自骨髓的MSC與中樞神經系統的NSC同屬先天之精,它們能相互轉化,而且MSC可能更是參與了中樞神經系統內的正常細胞更新,補腎填精法可能會對這種MSC向神經元樣細胞的分化起促進作用。他們采用龜板水煎液體外誘導rMSC分化為神經元樣細胞。陳東風等[14]報道rMSC經龜板含藥血清體外誘導后分化的神經元樣細胞神經絲蛋白表達陽性,誘導12 h后,神經元樣細胞陽性率達到高峰,細胞存活時間較長,至第7天仍有神經元樣細胞存活。鄺學媚等[15]報道三甲復脈湯含藥血清體外誘導成年大鼠骨髓間充質干細胞分化也有類似發現,而且其中以三甲復脈湯中細胞存活時間最長。

3 活血補血藥誘導間充質干細胞分化

當歸、丹參、三七、川芎等中藥具有活血補血、抗氧化等作用。近年來,隨著嚴善福等[16]發現牛膝多糖體外能促進MSC增值,更多的研究集中在活血補血中藥成分可體外誘導MSC向神經元樣細胞的分化上。孟凡剛等[17]用丹參誘導成年小鼠骨髓基質干細胞,分別于誘導后5 h、24 h、72 h進行免疫細胞化學染色,結果顯示巢蛋白(Nestin)和βⅢ-微管蛋白(βⅢ-Tubulin)均呈陽性表達。馮亞波等[18]分別采用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和丹參注射液聯合或2-巰基乙醇(2-ME)單種誘導骨髓間質干細胞(rMSCs),免疫組化鑒定NSE、NF、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)。結果顯示在體外用丹參注射液與bFGF聯合誘導可以使成年Wistar大鼠rMSCs分化為神經元樣細胞,并且存活時間明顯延長。余勤等[19]采用含丹參注射液的無血清Dulbecco改良Eagle培養基(DM EM)/F-12培養液誘導大鼠rMSCs分化為神經元樣細胞,通過觀察rMSCs經誘導后細胞的形態變化和采用免疫組化方法檢測神經元特異性核蛋白(NeuN)、神經絲蛋白(NFM)、GFAP的表達來鑒定神經元樣細胞。發現丹參注射液可以在體外誘導rMSCs分化為神經元樣細胞,其誘導分化率與丹參注射液的濃度有關。丹參能夠誘導骨髓間充質細胞向神經元分化的機制目前還不清楚,推測可能是丹參對處于活性氧應激狀態的細胞有保護作用,丹參注射液中的三種水溶性成分對維生素C2NADPH系統及Fe2+半胱氨酸系統誘發的腦微粒體脂質過氧化有很強的抑制作用,能夠清除氧自由基,這些可能是其對神經細胞產生保護作用的機制。

復方活血補血方劑及丹參的有效成分丹參酮都與丹參一樣,其具有的抗氧化作用可能與其定向誘導機制有關。武衡等[20]應用血清藥理學方法證實,腦溢安(鉤藤、生地黃、牡丹皮、三七、地龍等)含藥血清具有促進大鼠海馬MSC向神經元方向分化的作用,提高NSC分化為神經元的比率,此外尚具有促進神經細胞存活的作用。并認為腦溢安通過影響MSC的增殖、分化、移行來促進神經元再生、提高神經功能恢復水平。黃慧等[21]用香丹注射液(含丹參和降香)定向誘導大鼠MSC分化為神經元樣細胞,推測丹參的水溶性成分丹參素的抗氧化作用可能是產生定向誘導的主要原因之一。其可能機制是丹參素能抑制環核甘酸磷酸二酯酶的活力,提高胞內環核甘酸(cAMP)水平,后者進一步激活蛋白激酶A(p rotein kinase A,PKA)、p38ER K 1?2等信號傳導,最終引起神經突起發生和延長。另外,丹參素也可能通過刺激MSC產生白細胞介素而誘導或參與MSC定向分化為神經元樣細胞。夏文杰等[22]選用第5代、第10代的MSC以bFGF預誘導,再用丹參酮ⅡA和隱丹參酮誘導,發現大部分M SC可轉變為神經元樣細胞,并有軸突和樹突出現,多個神經元之間可形成網絡。前者誘導的神經細胞表達NSE、NFM,提示該細胞可能尚處于神經元前體細胞階段;后者誘導的神經細胞表達NSE、高分子量神經絲蛋白(neurofilament-H,NF-H),提示神經元趨向成熟,并推測兩者的誘導機制可能與其抗氧化作用有關。

4 芳香藥誘導間充質干細胞分化

中藥中走竄開竅的芳香類藥物(如含麝香陳芬的藥物)也能體外誘導MSC向神經元樣細胞分化。肖慶忠等[23,24]用含麝香多肽(musk polypeptide,Mu-p)或麝香酮(muscone,M u-n)的培養基體外定向誘導第5代～10代rMSC,結果發現細胞突起伸出,形似神經元,免疫組化同樣顯示誘導出的神經元樣細胞NSE、NF、巢蛋白表達陽性,GFAP陰性。神經元樣細胞計數分析發現MSC經Mu-p誘導后,NSE和NF-H陽性細胞的比例分別高93.5%和88.2%。而含Mu-n的培養基卻無上述變化。表明Mu-p能在體外誘導rMSC定向分化為神經元樣細胞,而Mu-n卻無此能力。研究中所誘導得到的神經元樣細胞可在體外存活時間較長(7 d后仍有約10%的神經元存活)。同時應用所獲得的神經細胞進行了大鼠脊髓橫斷性損傷和大鼠帕金森病的細胞替代治療發現其可重建相應的神經功能,證明其在體內發揮了相應的神經細胞功能,因此推測研究中所獲得的神經元樣細胞極有可能是有功能的神經元。Mu-p的誘導機制可能與其對神經細胞生長分化和突起生長的調節作用以及其具有抗氧化、抗損傷作用有關。黃潔等[25]采用血清藥理學方法,從體外實驗證實牛珀至寶微丸含藥血清體外誘導成年大鼠MSC分化為神經元。牛珀至寶微丸系由中醫急癥三寶之一的至寶丹化裁而來,主要藥物為水牛角、玳瑁、麝香、琥珀、血竭、藏紅花、大黃、石菖蒲等。

5 小結與展望

MSCs體外誘導向神經細胞分化,國外研究較多使用的是2-硫基乙醇、二甲亞砜、硫代甘油等作為誘導劑,但這些化學制劑均有一定毒性,不適宜應用于人體內,利用經臨床驗證的傳統中藥作為誘導劑,具有價廉、安全等優點,可望成為今后臨床神經細胞移植安全有效的誘導分化劑。但中藥誘導MSCs向神經元樣細胞分化研究中,尚有許多問題有待解決。如有關中藥誘導劑的研究并沒有報道其對MSCs誘導后的存活率情況,只是報道了誘導出的細胞表達了神經元的標志;而且大部分研究都沒有對誘導后細胞的功能進行檢測,能否有效的刺激宿主細胞分泌神經營養因子,促進神經損傷功能的恢復都需要進一步研究。雖然目前使用中藥誘導干細胞定向分化的研究工作才剛剛起步,其誘導機制也有待進一步深入研究。但中藥誘導干細胞定向分化技術無疑將推動醫學界一場新的革命,推動中醫藥要走向世界,走向現代化。

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