RNAi沉默STAT3基因聯合化療對人喉鱗癌細胞增殖的影響

郭慧 韓錦華 李東波 李曉明

信號轉導和轉錄激活因子(Signal transducers and activators of transcri-ption, STAT)是一類由細胞因子、生長因子、非受體類酪氨酸激酶等細胞外信號激活的轉錄因子[1]，在基因治療領域里，RNA干擾(RNA interference，RNAi)由于其具有高效性和高度特異性，是近年來基因組學研究的熱點，正逐漸發展成為關閉特定基因功能的關鍵技術[2]。頭頸鱗癌是常見的惡性腫瘤，針對其生長速度快、侵襲力強，對放化療的敏感性低、抵抗力強的特點，本實驗應用RNAi技術沉默STAT3基因，從對喉鱗癌細胞增殖的影響了解STAT3與喉鱗癌生物學行為和化療抵抗關系及機理。

1 材料與方法

1.1 材料 重組質粒構建與試劑，我們的前期工作已經成功合成與純化出重組質粒pGPU6/GFP/NeoshSTAT3(STAT3-siRNA),經DNA測序鑒定，重組質粒轉染采用脂質體轉染方法，人鱗狀喉癌細胞株hep-2培養在完全RPMI medium 1640。MTT為Sigma公司產品。

脂質體Lipofectamine 2000由invitrogen corporation 生產，兔抗人STAT3抗體。

1.2 方法研究

1.2.1 細胞轉染 HEP-2細胞常規培養至對數生長期，接種于培養瓶，細胞融合達40%～60%時分為五組進行轉染(1)脂質體轉染陰性對照組；(2)脂質體組；(3)DDP組；(4)脂質體轉染STAT3-siRNA組；(5)脂質體轉染STAT3-siRNA+DDP。其中DDP組加DDP(濃度4μg/ml[3])，STAT3-siRNA+DDP組先加STAT3-siRNA，6h后加DDP(濃度4μg/ml)。

1.2.2 細胞增殖狀態檢測 用MTT法。 接種HEP-2細胞于96孔板，貼壁后，無血清培養16～24h，實驗組分別加入陰性對照質粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP(濃度4μg/ml)。第0、1、2、3天分別加入MTT 5g/L，繼續培養4h，加入甲200μl，酶標儀測定490nm吸光度值，繪制生長曲線。

1.2.3 細胞周期檢測 無血清培養細胞16～24h，實驗組分別加入陰性對照質粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP。于24、48、72h分別消化細胞，PBS重懸，70%冰乙醇固定，37℃水浴1h，加入PI，4℃避光染色1h，流式細胞儀檢測。

1.2.4 流式細胞儀檢測蛋白的表達 無血清培養細胞16～24h，實驗組分別加入陰性對照質粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP。于24、48、72h分別消化細胞，PBS重懸，4%多聚甲醛固定，冰浴，分別加入相應的一抗、二抗，避光冰浴40min，上機檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件。數據比較采用方差分析、t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 STAT3-siRNA增強了DDP對Hep-2細胞的增殖抑制作用 研究結果發現，隨著時間的延長，DDP組表現出一定的增殖抑制效應，重組質粒組轉染后24h開始表現出一定的增殖抑制效應，72h表現出明顯的抑制效應，STAT3-siRNA重組質粒加化療組能顯著抑制Hep-2細胞的增殖活性，細胞出現了生長抑制現象，與STAT3-siRNA組、DDP組、脂質體對照組和陰性對照組相比，差異具有顯著統計學意義(P＜0.05)。(見表1)

2.2 STAT3-siRNA增強了DDP對Hep-2細胞周期的阻滯作用 STAT3-siRNA與DDP作用于Hep-2細胞72h后，G1期細胞比率由54.1%上升至73.0%，S期細胞比率由32.5%下降至6.9%。STAT3-siRNA組、脂質體組、DDP組、陰性對照組細胞S期比例在20.9%～32.4%之間。STAT3-siRNA+DDP組73.0%的細胞阻滯于G0/G1期，高于其余四組(P＜0.05)，具有統計學意義。(見圖1)

2.3 STAT3-siRNA與DDP對STAT3信號轉導通路成員表達的影響 重組質粒與DDP作用于喉癌Hep-2細胞72h后，p-STAT3蛋白表達與活性下調，其靶基因產CyclinD1表達下降。經兩樣本均數比較的方差分析，重組質粒加DDP組p-STAT3、CyclinD1的蛋白表達熒光指數(1.276±0.195，1.336±0.142)明顯低于其余四組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。(見表2)

3 討論

化學治療又稱抗癌藥治療，目前臨床上對于中、晚期惡性腫瘤常應用化療輔助手術及放療。順鉑是喉癌中晚期轉移患者化療的主要一線藥物，因其單藥總有效率不高，尤其以鉑類為基礎的聯合化療方案對喉癌的總有效率仍未見明顯提高[4]，故尋找有效的方法和試劑提高順鉑治療作用，對改善喉癌的療效意義極其重大。

本次實驗中應用流式細胞技術檢測，我們觀察到STAT3-siRNA重組質粒與DDP作用于Hep-2細胞72h后，p-STAT3蛋白表達與活性下調，其靶基因產物CyclinD1表達下降，而化療組和陰性對照細胞中上述指標無明顯變化，說明STAT3基因的沉默可以抑制STAT3的表達從而起到對順鉑增敏的作用。通常STAT3對細胞周期的調控作用主要表現為對基因Cyclin D1、c-Myc、Pim等的調控，過度表達Cyclin D1可以調節細胞周期前進，加快腫瘤細胞的增殖速度[5]。本次實驗中，我們使用STAT3-siRNA重組質粒轉染Hep-2細胞6小時后，加入4μg/ml濃度DDP，培養24h、48h、72h后，MTT法檢測各組細胞的生存率，結果發現STAT3-siRNA重組質粒加化療組能顯著抑制Hep-2細胞的增殖活性，細胞出現了生長抑制現象，與STAT3-siRNA組、陰性對照組和脂質體對照組相比，差異具有統計學意義，說明Hep-2細胞在封閉STAT3基因后抑制了Cyclin D1的作用，由對順鉑耐藥狀態轉變為對順鉑敏感。同時，流式細胞儀檢測結果也顯示，聯合應用STAT3-siRNA重組質粒和化療的細胞進入G0/G1期的細胞數較其余四組細胞有明顯增加，同時S期細胞數明顯減少；增殖指數PI下降，DNA合成期縮短，表明STAT3-siRNA與DDP聯合作用于喉鱗癌Hep-2細胞后，細胞G1期阻滯明顯，細胞增殖抑制作用增加。

表1 對喉癌Hep-2細胞的抑制率

圖1 FCM was used to show the cell cycle of Hep-2 cells transfected with STAT3 siRNA+DDP after 72h(a:Control; b:Liposome; c:DDP;d:STAT3-siRNA; e:STAT3 siRNA+DDP)

表2 p-STAT3, Cyclin D1的表達

通過本次實驗我們發現，STAT3-siRNA重組質粒具有增強化療抑制腫瘤細胞生長的作用，是增強化療敏感性的一個潛在的分子靶位點，有可能在不改變化療藥物劑量前提下，增加藥物療效。RNAi技術的治療效果在逆轉喉鱗癌化療耐藥中的有效性得到證實，加深了人們對化療抗性基因水平機制的了解，為我們在基因水平上改變腫瘤細胞的化療敏感性提供了線索。

[1]Levy DE,Darnell JE.STATs transcriptional control and biological impact[J].Nat Rev Mol cell biol,2002,3(9):651-662.

[2]Aimee LJ,Peter SL.Noise amidst the silence:off-target effects of siRNAs[J].TRENDS in Genetics,2004,20(11):521.

[3]王俊閣,李曉明,陳英會,等.信號轉導及轉錄活化因子3反義寡核苷酸聯合化療調控喉癌細胞增殖與凋亡的分子機制[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,42(3):222-226.

[4]張梅春,趙子文,劉朝暉,等.重組人可溶性凋亡配體相關蛋白聯合順鉑抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長[J].實用醫學雜志,2007,23(3):301-303.

[5]Niu G.Constitutive STAT3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesis.Oncogene,2002,21(13):2000-2008.