ING4和H IF-1α在人腦不同級別星形細胞瘤中表達的研究

趙樹鵬 牛光明 陶勝忠 張鵬遠 宋 樂 尹先印 蘇芳忠

鄭州大學第二附屬醫院神經外科 鄭州 450014

ING4基因是2003年發現的一種強的候選抑癌基因[1],它通過抑制腫瘤血管增生、調控細胞增殖和凋亡及細胞的接觸抑制等抑制腫瘤細胞的生長。缺氧誘導因子-1α(H IF-1α)是一種重要的轉錄因子,能促進腫瘤的血管生成,對腫瘤迅速增長起著重要的作用。本實驗通過對45例星形細胞瘤標本中ING4和H IF-1α蛋白檢測,研究二者在星形細胞瘤發生和發展過程中的作用,為進一步揭示腫瘤的發病機制、診斷及治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 45例人腦星形細胞瘤均取自鄭州大學第二附屬醫院神經外科2009-01～2009-07手術切除標本。男25例,女20例,年齡2～77歲,平均(41.8±18.3)歲。所有病例均為原發病例,術前未經放化療。標本切除后中性福爾馬林液固定保存,進行脫水、透明、浸蠟、包埋,蠟塊連續切片,厚約4μm,HE染色后觀察。按照2000年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準[2],其中Ⅰ級 6例,Ⅱ級 18例,Ⅲ級14例,Ⅳ級7例。把24例Ⅰ～Ⅱ級設為低度惡性實驗組,21例Ⅲ～Ⅳ級設為高度惡性實驗組。11例正常腦組織為對照組,取自腦外傷、腦出血、腦動靜脈畸形病人內減壓者。

1.2 方法 應用免疫組化法檢測,厚約4μm組織切片常規脫蠟,按S-P盒說明進行。以PBS代替一抗作為陰性對照,兔抗人ING4多克隆抗體和兔抗人H IF-1α單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,S-P試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司,所用兩種兔抗人抗體的終濃度為1∶100。

1.3 染色結果判定 ING4陽性表達以細胞核和或胞漿內出現棕黃色顆粒為準,HIF-1α表達于胞核或胞質,但主要是核表達,呈棕黃色。參考H iroshi等[3]提到的方法,隨機選10個高倍視野,依照細胞著色密度和著色強度半定量評分: (1)染色細胞百分比:未見染色為0分,≤25%細胞染色為1分,25%～50%細胞染色為2分,＞50%細胞染色為3分; (2)依陽性細胞染色強度:未見染色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,上述兩者之和的總得分來判定結果,＞2分定義為陽性表達(+),≤2分定義為陰性表達(-)。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學處理,統計方法采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 ING4的染色結果 ING4陽性染色細胞可見細胞核和(或)胞漿內出現棕黃色或褐黃色均質顆粒,主要位于胞核,也可見于腦膠質細胞、腦錐體細胞、血管內皮細胞及間質纖維組織。正常腦組織均見表達,明顯高于星形細胞瘤中的表達,且在Ⅰ～Ⅱ級組中陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ級組,差異均有統計學意義。見表1。

表1 ING4蛋白在正常腦組織和星形細胞瘤中的表達

2.2 H IF-1α的染色結果 H IF-1α陽性表達主要定位于腫瘤細胞核,部分位于胞漿內,呈黃色或棕黃色的染色顆粒,以腫瘤壞死區邊緣最為明顯。正常腦組織中未見表達,明顯低于星形細胞瘤中的表達,且在Ⅰ～Ⅱ級組中的陽性表達率低于Ⅲ～Ⅳ級組,經統計學處理,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 HIF-1α蛋白在正常腦組織和星形細胞瘤中的表達

2.3 ING4和H IF-1α之間的關聯性 19例ING4表達陽性的星形細胞瘤中H IF-1α表達陽性8例,26例ING4表達陰性的星形細胞瘤中H IF-1α表達陽性24例,經χ2檢驗,兩者呈負相關,相關系數r=-0.480。見表3。

表3 ING4蛋白和H IF-1α蛋白表達的關系

3 討論

20世紀90年代,已認識到腫瘤是一種細胞周期調控異常性疾病,幾乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效應均與細胞生命活動異常有關[4]。ING 4是生長抑制因子家族中的一個新成員,研究表明ING 4能夠與P300相互作用促使P53乙酰化,誘導細胞發生G2/M期周期阻滯,抑制細胞生長和誘導細胞凋亡,且ING4還能抑制腫瘤血管的生成。ING4基因的缺失或突變,與多種腫瘤的形成有關。Suw on Kim等[5]通過比較基因組雜交技術(CGH)分析了ING4基因周圍的缺失程度,發現T47D乳腺導管癌至少有兩個拷貝的缺失。另外,Garkavtsev等[6]采用實時RT-PCR的方法對50例神經膠質瘤和5例正常對照腦組織中ING4基因mRNA水平進行檢測,結果顯示ING 4基因在神經膠質瘤中的表達下降,且與腫瘤惡性程度有關,級別越高表達水平越低。本實驗結果與此一致。ING4蛋白在星形細胞瘤中表達降低,且與惡性程度呈負相關,提示ING4基因由于在星形細胞瘤中的缺失和突變,使腫瘤血管生成增多,細胞增殖加速和凋亡減少,是星形細胞瘤發病的關鍵因素。ING4有可能成為一個基因治療的候選分子,通過對其表達的調控,進而有效地控制星形細胞瘤的發生發展。

H IF-1α是一種重要的轉錄因子,可以誘導腫瘤細胞耐受缺氧狀態,促進腫瘤血管的生成。研究表明 H IF-1α對VEGF及多種糖酵解酶起著轉錄調控作用,并促進腫瘤生長,與惡性腫瘤的關系密切。Zagzag等[7]對30例不同級別的膠質瘤和10例血管母細胞瘤研究發現高惡性膠質瘤比低惡性者的H IF-1α表達強。同時Zhong等[8]對10例正常腦組織進行免疫組化染色,發現HIF-1α蛋白表達均為陰性。本實驗檢測結果與此相符,并發現H IF-1α蛋白在腫瘤缺氧壞死區邊緣最為明顯,且以高度惡性組多見,提示腫瘤細胞局部的缺氧使HIF-1α基因轉錄,可以對下游基因VEGF及多種糖酵解酶起調控作用,促進腫瘤血管生長,在腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移過程中起重要作用。

近期有文獻報道ING4可通過抑制 HIF-1α的活性,減少IL-8的表達,抑制腫瘤血管的生成,但具體機制尚不清楚,在星形細胞瘤中尚未見報道。2005年,Ozer等[9]發現ING 4水平和細胞內低氧狀態下誘導產生的H IF-1α靶基因的表達呈負相關。結合本實驗,在ING4陽性表達的星形細胞瘤標本中,HIF-1α趨向為陰性表達,呈負相關(r=-0.480)。由此我們可以推測可能存在這一機制,ING 4通過抑制H IF-1α的活性,使其失去對下游基因VEGF及多種糖酵解酶的調控作用和減少IL-8的表達,來減少腫瘤血管的生成,抑制腫瘤細胞的生長。總之,ING4的失活和H IF-1α的激活共同參與了星形細胞瘤的發生和發展過程,但二者之間的相互作用機制有待進一步研究證實。進一步認識ING4和H IF-1α在星形細胞瘤發病中的作用,可為腫瘤的治療提供新靶點及新思路。

[1] Shiseki M,Nagashima M,Pedeux RM,et al.P2ING4 and P28ING5 bind to P53 and P300,enhan ce P53 activity[J].Cancer Res,2003,63(10):2 373-2 378.

[2] K leihues P,CaveneeWR.WHO classification of tumors pathology and genetics of tum ors of the nervous system[J].Lyon IARCPress,2000,1:253.

[3] Hiroshi K,Noriharu S,Shosaku A.Thym idine phosphorylase and vascular end dothelial grow th factor in patien ts w ith stageⅠlung adenocarcinoma[J].Can cer,2002,94:1 083.

[4] 鄭杰,宋來君,孫紅衛,等.Skp2和PTEN在人腦星形細胞瘤中的表達及臨床意義[J].中國實用神經疾病雜志,2008,11 (1):9-11.

[5] Kim S,Chin K,Gray JW,et al.A screen fo r genes that supp ress loss of contact inhibition:Identification of ING4 asa candidate tum or suppressor gene in hum an cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(46):16 251-16 256.

[6] Garkavtsev I,Kozin SV,Chernova O,et al.The candidate tum ou r suppressor protein ING4 regu lates brain tumou r g row th and angiogenesis[J].Natu re,2004,428(6980):328-332.

[7] Zagzag D,Zhong H,Scalzihi JM,et al.Exp ression of hypoxia inducible factor 1 alpha in b rain tumors:association w ith angiogenesis,invasion,and progression[J].Cancer,2000,88(11):2 606-2 618.

[8] Zhong H,DeMarzoA M,Laughner E,et al.Overpression of hypoxia-inducib le factor 1 alpha in comm on human cancers and their etastases[J].Can cer Res,1999,59(22):5 830-5 835.

[9] Ozer A,W u LC,Bruick RK.The candidate tumor supp ressor ING4 repressesactivation of the hypoxia inducible factor(H IF) [J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(21):7 481-7 486.