鹽酸美金剛對血管性癡呆大鼠海馬CA 1區BDNF及ERK表達的影響

張曉鋒 陳淅泠 王欣東

鄭州大學第二附屬醫院干部病房 鄭州 450014

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是各種腦血管病引起的獲得性智能損害和認知障礙的綜合征,為一種慢性進行性疾病。作為一種神經保護劑,鹽酸美金剛已被批準在臨床中治療阿爾茨海默病。Kavirajan等[1]進行的一項系統評價和匯總分析也證實了其對血管性癡呆的療效以及較好的安全性和耐受性。目前的研究集中在鹽酸美金剛為中等親和力、非競爭性、電壓依賴性NMDA受體阻斷劑。最近的研究顯示鹽酸美金剛的神經保護作用可能涉及其他的作用機制[2-3]。本研究通過建立血管性癡呆的大鼠模型,觀察大鼠的學習記憶能力、海馬神經元的形態學變化及海馬神經元BDNF和ERK表達,探討鹽酸美金剛治療血管性癡呆的機制和神經保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康雄性W istar大鼠48只(河南省醫學動物實驗中心提供),14～15月齡,體質量(400±50)g。

1.1.2 主要儀器及試劑:MG-2 Y-型迷宮(張家港市生物醫學儀器廠),BDNF和ERK免疫組化試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司),鹽酸美金剛(商品名易倍申,丹麥靈北藥廠制造)。

1.2 方法

1.2.1 分組和模型制備:將大鼠隨機分為假手術組、模型組和鹽酸美金剛治療組,每組16只。給予大鼠適應性飼養1周,采用雙側頸總動脈(CCA)永久結扎法制備模型。將大鼠用10%的水合氯醛(0.3 m l/100g)腹腔注射,麻醉成功后仰臥固定在手術臺上,常規消毒,頸正中切口,模型組和鹽酸美金剛組分離雙側頸總動脈,4號絲線雙重結扎后,縫合切口,放回籠中保溫飼養。假手術組只分離雙側頸總動脈不結扎,余操作過程相同。藥物治療組于造模術后第2天按體質量3 mg/(kg?d)經胃管給予鹽酸美金剛,1次/d,共6周。假手術組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。

1.2.2 Y-型迷宮試驗:灌胃結束后用Y-型迷宮測試學習記憶能力。將大鼠放入迷宮內適應5 m in,使其對三臂均探索進入。然后從起步區臂出發,開始以隨機次序變換測試。設定電壓75 V,延遲5 s。電擊后大鼠直接逃避至安全區為正確反應,否則為錯誤反應。每測1次休息30 s,測10次休息5 min。以連續10次測試中有9次正確反應即為達到學會標準,記錄動物達到標準所需電擊的次數,以此作為學習能力的指標。24 h后,重復以上實驗過程,觀察大鼠的記憶能力。每次測試均在安靜的、光線稍暗的條件下進行。

1.2.3 H E染色和免疫組化技術:Y-型迷宮試驗后,將大鼠麻醉后,立即開胸暴露心臟,迅速左心室插管,同時剪開右心房,快速灌注生理鹽水,待肝臟變白后,改灌4%多聚甲醛溶液(4℃,pH=7.4)250 m l,速度先快后慢,至大鼠四肢僵硬為止,取出腦組織,置于4%多聚甲醛中浸置24 h,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋,連續冠狀切片,片厚約5μm,進行HE染色觀察形態學變化,采用SP免疫組化法檢測BDNF和ERK,步驟嚴格按說明進行。

1.2.4 圖像分析及統計學方法:采用Qwin550 CW圖像處理與分析系統,檢測陽性反應物質的平均灰度值。每張切片同一區域中,隨機選取8個視野,檢測面積大致相同,采集8組數據,取其平均值作為該切片目標區域的平均灰度值。所有數據以均值±標準差表示,使用SSPS 13.0統計軟件,采用單因素方差分析法,用S-N-K法進行組間的兩兩比較。P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Y-型迷宮試驗 鹽酸美金剛組的學習和記憶成績高于模型組,但不及假手術組,差異均有統計學意義。見表1。

表1 各組大鼠學習記憶成績 (±s)

表1 各組大鼠學習記憶成績 (±s)

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2.2 大鼠海馬CA 1區神經元形態學比較 假手術組神經元數量多,排列緊密、均勻、整齊,胞核呈圓形或橢圓形,核仁明顯,染色質均勻;VD組神經元結構松散,數目減少,排列紊亂,胞核深染、固縮,核仁消失,胞漿周圍發現空暈,胞間距較大;鹽酸美金剛組正常神經元數量較多,排列較密,胞核呈圓形或橢圓形,核仁清晰,染色質豐富,少見固縮變性的神經元。

2.3 大鼠海馬CA 1區免疫組化結果 BDNF和ERK免疫陽性細胞胞漿內出現棕黃色顆粒。假手術組見少量弱染及中等強度染色的BDNF陽性神經元;模型組層次減少,排列疏松,但殘余的BDNF陽性神經元胞漿內著色明顯加重,呈棕黃色,并可見胞核著色;鹽酸美金剛組BDNF陽性神經元數大量增加。假手術組海馬CA 1區有大量的ERK免疫反應陽性神經元,呈棕黃色,胞體較大,圓形或橢圓形;而模型組陽性神經元數目明顯減少,胞體變小,核固縮;鹽酸美金剛,可見陽性神經元數目較模型組增多,胞體變大。3組間的陽性區平均灰度值均有顯著性差異。見表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區BDNF和ERK陽性區平均灰度值 (±s)

表2 各組大鼠海馬CA1區BDNF和ERK陽性區平均灰度值 (±s)

注:與假手術組相比,*P＜0.01;與模型組相比,#P＜0.01

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3 討論

本實驗病理組織學檢查發現,鹽酸美金剛能減少海馬神經元的缺血壞死,減輕腦組織的不可逆損害,起到神經保護作用,血管性癡呆大鼠經鹽酸美金剛治療后Y-型迷宮試驗成績得到提高,改善了其學習與記憶能力。

腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)對多巴胺能神經元及其他神經系統有營養及保護作用[2], M iyake等[4]學者發現微球體梗死動物后,BDNF的蛋白水平在海馬升高;同樣,Zhao等[5]研究表明大鼠中動脈阻塞后,大鼠缺血側前腦皮質和海馬的BDNF水平也較對側大腦半球高,暗示缺血后損害的恢復。本實驗結果也顯示,大鼠在慢性腦缺血后海馬部位的內源性BDNF表達增高,但這種表達水平有限,難以對受損神經元起全面持久的保護作用,在應用鹽酸美金剛后內源性BDNF顯著上調,而且病理組織學改變相應減輕。ERK(含ERK 1和ERK2),又稱p44MAPK和p42M APK,是細胞內重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,p-ERK是其活性形式。ERK的底物包括細胞內其他重要的激酶、轉錄因子、組蛋白以及K+通道等,這些物質是細胞內的重要組成成分,在學習記憶形成過程中必不可少,同時ERK可能參與了神經元形態學可塑性的形成過程[6]。本研究發現ERK在模型組大鼠海馬CA 1區表達下降,因而推測VD模型大鼠學習記憶能力下降與海馬CA 1區ERK表達下降有關。應用鹽酸美金剛治療后,ERK表達增高,鹽酸美金剛可能通過促進ERK表達改善學習記憶能力。但鹽酸美金剛通過何種途徑上調BDNF和ERK的表達,尚需進一步的研究。

綜上所述,鹽酸美金剛不僅可以通過拮抗NM DA受體過度活化造成的興奮神經毒性作用,起到神經保護作用[7],治療血管性癡呆,也可能通過提高內源性BDNF表達,起到神經保護作用,增加ERK表達,改善學習記憶能力。本研究結果為研究鹽酸美金剛治療血管性癡呆的機制和神經保護機制提供了一個新的方向。

[1] Kavirajan H,Schneider LS.Efficacy and adverse effectsof cholinesterase inhibitors and memantine in vascular dementia:a m eta-analysis of random ised controlled trials[J].Lancet Neurol,2007,6(9):782-792.

[2] M arvanova M,Lakso M,Pirhonen J,et al.The neu roprotective agentmemantine induces brain-derived neu rotrophic factor and trkB receptor exp ression in rat brain[J].Mol Cell Neurosci, 2001,18:247-258.

[3] Jantas D,Szym anska M,Budziszew skaB,et al.An involvement of BDNF and PI3-K/AK t in the an ti-apoptotic effect ofmem antine on staurosporine-evoked cell death in p rim ary cortical neurons[J].Apoptosis,2009,14:900-912.

[4] M iyake K,Yamam oto W,Tadokoro M,et al.A lterations in hippocam pal GA P-43,BDNF,and L 1 follow ing sustained cereb ral ischem ia[J].Brain Res,2002,935:24-31.

[5] Zhao LR,Risedal A,W ojcik A,et al.Enriched environmen t influences b rain-derived neuro-trophic facto r levels in rat foreb rain after focalstroke[J].Neurosci Lett,2001,305:169-172.

[6] 胡亞卓,呂佩源,李玲,等.鹽酸多奈哌齊對血管性癡呆模型小鼠海馬神經元 ERK表達的影響[J].中國神經免疫學和神經病學雜志,2008,15(1):46-49.

[7] Lipton SA.Paradigm shift in neurop rotection by NMDA receptor blockade:memantine and beyond[J].Nat Rev D rug Discov, 2006,5(2):160-170.