環境中甾體激素降解菌的篩選及功能基因的克隆

于源華，宋禹，何秀霞，王寶德，劉華，李金海，熊光明

(1.長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022；2.長春衛爾賽生物藥業有限公司，長春 130022)

隨著工農業的發展，水資源甾體激素污染愈加嚴重，這不僅僅危害人類健康而且危及到所有動物的生存和發展[1]。甾體激素在江水、河水、湖水及海水中都被檢出[2-3]。其含量超標可能造成男性女性化，還將引起男性前列腺癌，女性乳腺癌等[4]。

另有美國Julio E.Cabrera學者[9]報道了3,17-羥基類固醇脫氫酶基因，其編碼的3,17-HSD能夠降解固醇類固醇激素，如果從中國領域內篩選到相關的菌種并克隆出關鍵基因將為我們治理日益嚴重的環境激素污染起到重要作用。

1 材料

海水樣品：采樣地點位于大連海港附近，疑為被城市甾體激素污染。

菌種：HB101(實驗室保存)。

質粒：pCR2.1-TOPO(Invitrogen購買)。

試劑：LB培養基，SIN培養基，kannmycin(北京鼎國)，雌二醇，睪丸酮，膽固醇(sigma)，3-HSD/CR兔抗體(本實驗室制備)。

儀器：熒光酶標儀(BioTek)，全溫振蕩培養箱(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司)，電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，日立CF-16RX高速冷凍離心機，紫外分光光度計(日立U-2800)PCR儀(eppendorf)。

2 方法

2.1 環境中甾體激素降解菌的篩選

從大連海港8個不同地點取了8種水樣。將水樣至于50mL離心管中，4000rpm，離心10min。取靠近底部沉淀物的2mL水至于EP管中，取400uL在含有2.6%NaCl和1mM睪丸酮的SIN瓊脂糖培養基上涂布，27℃過夜培養。挑取8個平板的單菌落(每個平板5個單菌落)到50uLSIN培養基中并編號記錄，混勻后各取2uL分別在A(無睪丸酮)和B(含有1mM 睪丸酮)平板上點樣。27℃過夜培養。A、B平板為1:10稀釋的SIN瓊脂糖培養基，含2.6%NaCl。

2.2 H5-1菌株的培養

H5-1菌株在含2.6%NaCl的 LB培養基中，27℃，180rpm，恒溫搖床里培養12h備用。接于新的含2.6%NaCl的LB培養基中，27℃，180rpm恒溫搖床里擴大培養5-6h備用。H5-1菌株在含 kan(30g/ml)2.6%NaCl的 LB 培養基，27℃，180rpm的恒溫搖床里培養12h備用。

2.3 ELISA檢測3-HSD/CR

2.4 3，17-羥基類固醇脫氫酶(3，17-HSD)目的基因的克隆

根據GeneBank中報道的EF488080.1的3,17-HSD基因序列設計上下游引物，以 H5-1染色體DNA為模板，上游引物 P3-17L:5'-CATATGACAAATCGTTTGCAG-3'，下游引物P3-17R:5'-GGATC CATCTATAGCCCCATG-3'得到765bp的3,17-HSD基因片段。將該片段與載體 PCR2.1-TOPO連接制得pTOPO-3,17-HSD并轉化到HB101感受態細胞中，通過Kan、Amp雙抗性篩選得到HB-17突變菌株。再通過電擊與 H5-1菌株雜交，抗性篩選出H5-1突變株。

2.5 ELISA檢測3，17-HSD

為了定量3,17-HSD，建立 ElISA檢測方法，抗 3,17-HSD兔抗體由本實驗室按照標準方法制備。將含3,17-HSD蛋白樣品包被在酶標板上，蛋白含量定于 1mg/mL，封閉洗滌之后每孔加入200uL1:10000稀釋的3,17-HSD抗體，加入二抗染色終止。

圖1 篩選降解水中雌激素的細菌Fig.1 The bacteria of estrogen in screening degradated water

圖2 H5-1的顯微鏡下結構觀察圖Fig.2 The structure graph under HS-1 microscope

圖3 不同溫度條件下甾體激素誘導H5-1表達3-HSD/CR蛋白Fig.3 The steroid hormone induce H5-1 express 3-HSD/CR protein in different temperature

圖4 不同濃度的甾體激素誘導H5-1表達3-HSD/CR蛋白Fig.4 The steroed homone induce H5-1 express 3-HSD/CR protein in different density

圖5 H5-1菌株對膽固醇的降解作用Fig.5 The degradation of cholesterol by strain

3 結果

3.1 菌株篩選

通過27℃過夜培養，所有的40接種單菌落在B平板上均能良好生長，只有8個接種單菌落不能在A平板上生長(圖1)。很明顯，這8個菌落在B平板上可以利用睪丸酮作為碳源生長，而在同樣低營養條件且不含睪丸酮的A平板上無法生長。根據進一步的篩選，(第3次接種于1：10稀釋的SIN瓊脂糖培養基，含2.6%NaCl，1mM睪丸酮)從這8單菌落中得到一個單菌落，這種菌具有與睪丸酮叢毛單胞菌相似的特性，命名為H5-1。

A、B均為1：10稀釋的SIN培養基且含2.6%NaCl，B中另含有1mM睪丸酮。

經過革蘭氏染色后的 H5-1的顯微鏡下照片顯示為革蘭氏陰性菌(圖2)。

3.2 H5-1中3-HSD/CR活性

在不同濃度和不同溫度條件下H5-1被雌二醇，睪丸酮誘導均可以使3-HSD/CR不同程度大量表達，但被膽固醇誘導3-HSD/CR表達量卻沒有增加。而且H5-1最適誘導溫度為27℃至37℃，最適誘導濃度為0.3mM(圖3、4)。

3.3 H5-1對膽固醇的降解

為了確定H5-1的降解能力及H5-1是否對膽固醇有降解作用，我們將培養好的 H5-1菌液加入到已知膽固醇含量的測試液中，恒溫27℃，1h后檢測測試液中的膽固醇含量。

由加入 H5-1菌液前后測試液中的膽固醇濃度可知，27℃1h后，測試液中0.5mM的膽固醇80%以上被降解(圖5)。

3.4 3，17-HSD的基因克隆

圖6 3，17-HSD基因PCR電泳圖Fig.6 The electrophoretic graph of 3，17-HSD gene

此圖顯示了3條PCR擴增條帶，分別是740bp、600bp、380bp。

4 討論

該基因的成功克隆，為本課題組進行目的蛋白的表達、酶活性測定研究及利用分子克隆技術將綠色熒光蛋白報告基因(GFP)通過同源重組整合進H5-1染色體 DNA中，構建出H5-1熒光變異菌株奠定了工作基礎。

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[6]Guangming Xiong，Hans-Jorg Martin，Andreas Blum，et al.A model on the regulation of 3-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase expression in Comamonas testosteroni[J].Chemico-Biological Interactions，2001，130-132 ：723-736.

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