雷帕霉素抑制m TOR信號通路對EC9706細胞生長及凋亡的影響*

王瓊葉,侯桂琴,王莉莉,薛樂勛

1)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤細胞生物研究室鄭州 450052 2)鄭州大學藥學院藥理學教研室鄭州 450001 3)鄭州大學生物工程系細胞生物研究室鄭州 450001

#通訊作者,男,1942年2月生,教授,研究方向:腫瘤與生物工程,E-mail:xuelx@371.net

細胞生長要受到高度復雜和精密的調控,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在細胞生長的調控過程中起重要作用,是細胞生長的中心調控因子[1]。以 m TOR為中心構成的信號傳導網絡在細胞生長過程中發揮關鍵作用。研究[1-3]表明,mTOR信號通路在細胞的生存、生長與增殖中起中心調控作用,它所介導的信號轉導通路的異常與多種惡性腫瘤有關,已成為腫瘤治療的新靶點。mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin,rapa)是新型大環內酯類藥物,對前列腺癌、乳癌及胰腺癌等惡性腫瘤均有一定療效[4]。mTOR信號通路在食管鱗狀細胞癌的發生發展中是否起作用以及rapa是否對食管鱗狀細胞癌的生長增殖有抑制作用,國內外尚未見報道。作者采用免疫組化 SP法檢測食管鱗狀細胞癌組織中mTOR的表達情況,通過流式細胞術檢測rapa對食管鱗狀細胞癌細胞生長及凋亡的影響,為食管鱗狀細胞癌的分子靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細胞來源 HRP標記羊抗鼠IgG、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;mTOR(sc-8319)抗體購自美國Santa Cruze公司;rapa、碘化丙啶(PI)購自美國Sigma公司;RNase購自大連寶生物公司,Annexin VFITC細胞凋亡試劑盒購自美國BD Biosciences公司。EC9706細胞由中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈。

1.2 標本來源 取2001年 1月 1日至 2006年 8月 1日在安陽市腫瘤醫院胸外科行初次手術且有完整臨床病理資料的食管鱗狀細胞癌組織石蠟標本50例,均經病理檢查確定診斷。男 30例,女 20例,年齡 49～67歲,中位年齡 58歲;術前均未接受過化療及放療。以來自食管癌病發區無癥狀人群食管活檢組織 15例(男 9例,女 6例,年齡40～59歲,中位年齡47歲)作為陰性對照。

1.3 細胞培養 細胞在含體積分數為10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養液(美國Gibco公司)中生長,并置于37℃,體積分數為 5%CO2的條件下培養。

1.4 食管鱗狀細胞癌及正常食管組織中m TOR蛋白的檢測 石蠟切片標本常規脫蠟至水,嚴格按免疫組化試劑盒說明操作,DAB顯色。mTOR一抗工作濃度1:50。選擇5個視野(×400)的1 000個細胞進行觀察。結果判定[5]:胞漿中有清晰棕褐色顆粒者為陽性細胞。著色強度計分:陰性為 0分;弱為1分;中等為2分;強為3分。著色分布計分:未著色為0分;10%～為1分;51%～為2分; 90%～100%為 3分。著色樣式計分:未著色為 0分;零星著色為1分;聚集著色為 2分;彌散著色為 3分。結果取 3項計分之積:0分為陰性,≥1分為陽性。

1.5 細胞周期測定 取處于對數生長期細胞,分別用20、50和100 nmol/L rapa處理,24 h后收集細胞并制備單細胞懸液,用體積分數為 70%冷乙醇固定,4℃過夜。約106個細胞移入離心管中,PBS洗3次,加入RNase室溫消化1 h,然后加入碘化丙啶(PI)染液,染色30 min,流式細胞儀檢測各組中靜止期(G0/G1)、合成期(S)、合成后期和分裂期(G2/ M)的細胞比例。用未處理細胞作為對照。實驗重復3次。

1.6 細胞凋亡檢測 取處于對數生長期細胞,分別用20和50 nmol/L rapa處理,24 h后收集細胞并制備單細胞懸液,用 100μL冰預冷 1×結合緩沖液重懸細胞,將試管置于冰上;加5μL Annexin V-FITC和2.5μLPI到100μL的細胞懸液中,輕輕混勻;將試管置于冰上,室溫避光孵育15 min;加入400μL 1×結合緩沖液,輕輕混勻,在 30 min內分析結果,以凋亡試劑處理的細胞作為陽性對照,未處理細胞作為陰性對照。以未染色細胞調零機器,以Annexin V-FITC單染管和PI單染管作為基準參照,測定每個上樣管數據,利用CellQuest3.0軟件進行參數獲取和資料分析,計算 I區(繼發死亡細胞區),Ⅱ區(早期凋亡細胞區)和Ⅲ區(活細胞區)的細胞百分比。實驗重復 3次

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0進行分析,食管鱗狀細胞癌和正常食管組織中mTOR的表達采用χ2檢驗,各組細胞周期分布和凋亡率的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 食管鱗狀細胞癌和正常食管組織中mTOR的表達 mTOR主要在胞漿中表達(圖1)。m TOR在食管鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率為 64.0% (32/50),較正常食管組織的13.3%(2/15)高(χ2= 11.873,P=0.001)。

圖1 正常食管組織及食管鱗狀細胞癌組織中m TOR的表達(SP,×400)A:正常食管組織;B:食管鱗狀細胞癌組織。

2.2 rapa對EC9706細胞周期的影響 見表2。

表2 不同濃度rapa對EC 9706細胞周期的影響(n=10) %

2.3 rapa對EC9706細胞凋亡的影響 見表3。

表3 不同濃度rapa對EC 9706細胞凋亡的影響 %

3 討論

mTOR信號轉導通路在調節細胞的凋亡、增生、分化等過程中起重要作用,與惡性腫瘤的發生、發展關系密切,已成為腫瘤治療的新靶點[6]。mTOR在多種腫瘤中被顯著激活而促進腫瘤發生,并且mTOR可直接使p70S6K磷酸化(p-p70S6K),pp70S6K促翻譯活性高出未磷酸化p70S6K 100倍左右,從而促進蛋白合成[7],抑制此通路可以使細胞周期停滯,從而促進細胞凋亡產生[8]。研究[9-10]顯示rapa衍生物及其細胞周期抑制劑779對前列腺癌、乳癌、胰腺癌等惡性腫瘤的良好的抗腫瘤作用。

目前針對食管鱗狀細胞癌中mTOR信號通路的研究較少,該研究著重探討食管鱗狀細胞癌中mTOR信號通路的狀態以及rapa是否抑制食管癌細胞的生長增殖,從而為食管鱗狀細胞癌的靶向治療尋找有效的藥物。該研究通過免疫組織化學結果顯示mTOR蛋白在食管鱗狀細胞癌細胞中的表達較正常食管組織高,提示mTOR通路在食管鱗狀細胞癌組織中處于激活狀態,下一步的研究將通過檢測mTOR下游靶蛋白來進一步證實該通路的激活狀態。流式細胞術結果顯示:不同濃度rapa處理組滯留在G0/G1期的細胞比例高于未處理組,提示rapa可使細胞滯留在G1期,從而抑制細胞的增殖;同時處于Ⅱ區(早期凋亡細胞區)的細胞比例處理組高于未處理組,提示rapa誘導細胞凋亡。但是rapa的促凋亡機制是否因為細胞長期處于 G1期而觸發了凋亡還有待進一步證實。

綜上所述,該研究初步探討了食管鱗狀細胞癌發生的可能分子機制即m TOR信號通路的激活在食管鱗狀細胞癌的發生發展中起著一定的作用,而mTOR的抑制劑rapa可抑制食管鱗狀細胞癌細胞生長并誘導凋亡,從而為靶向治療食管鱗狀細胞癌提供實驗依據。

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