熱化療對Raji細胞生長、JNK通路及熱休克蛋白70表達的影響*

劉新奎1,2),王 琳3),張明智2)#

1)鄭州大學第一附屬醫院病案管理科;河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院放療科;河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室鄭州 450052

#通訊作者,男,1959年1月生,博士,教授,主任醫師,研究方向:惡性淋巴瘤的基礎與臨床,E-mail:mingzhi_zhang@126.com

淋巴瘤是一組原發于淋巴結和(或)結外部位淋巴組織的淋巴細胞或組織細胞的惡性腫瘤[1]。淋巴瘤的臨床治療主要有化療、放療及造血干細胞移植治療,但均存在選擇性不高的缺點,治療中常出現較明顯的毒副反應,且易復發。熱療被認為是繼手術、放療、化療及生物療法之后的第 5種治療腫瘤的方法[2]。該研究中作者將加熱與治療淋巴瘤常用的化療藥物阿霉素聯合應用,觀察其對人淋巴瘤Raji細胞生長以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號轉導通路和熱休克蛋白70(HSP70)表達的影響,探討熱化療作用的可能機制,為腫瘤熱療的臨床實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑與儀器 細胞株:Raji細胞株購自中國科學院細胞研究所。主要試劑:阿霉素注射液(太極集團四川太極制藥有限公司)、噻唑藍(Sigma公司)、鼠抗人HSP70單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)、兔抗人JNK抗體和p-JNK (Thr183/Tyr185)抗體(美國Cell Signaling公司)、辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG和辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)。主要儀器:垂直電泳槽、電轉儀、Sunrise酶標儀及恒溫水浴箱。

1.2 實驗分組 參考臨床常用劑量,按如下方式進行分組:單純化療組(加入3.00 mg/L阿霉素,37℃培養24 h)、單純熱療組(43℃水浴加熱30 min,37℃培養24 h)、熱化療組(加入3.00mg/L阿霉素, 43℃水浴加熱 30 min,37℃培養 24 h)及對照組(37℃培養24 h)。

1.3 細胞增殖率測定 采用MTT法檢測。取對數生長期的細胞,常規消化制成單細胞懸液,調整細胞密度為2.5×104mL-1,接種于 96孔板,每孔 0.2 mL,置37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養24 h,按1.2中設計處理細胞后放回37℃、體積分數 5% CO2培養箱繼續培養48 h;每孔加入5 g/L MTT液20μL,繼續孵育4 h,取出培養板,加入150μL二甲基亞砜(DMSO),微量振蕩器振蕩10 min,以DMSO調零,酶聯免疫檢測儀檢測492 nm波長下每孔的吸光度(A)值。每組設 6個復孔,重復 3次。細胞生長增殖率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4 各組細胞JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及HSP70蛋白的檢測 離心收集各組細胞,將約 1× 106個細胞置于細胞裂解液中,在冰水浴中反復吹打進行破碎,4℃、10 000 r/m in離心10 min,吸取上清液,即為細胞提取液。進行總蛋白定量,調整蛋白濃度一致后,進行SDS-PAGE電泳,然后轉移至硝酸纖維素膜上,分別以鼠抗人 HSP70抗體、兔抗人JNK抗體和兔抗人p-JNK抗體為一抗,辣根酶標記山羊抗小鼠或抗兔IgG為二抗,進行Western Blot分析,化學發光法顯色后,應用GeneTool圖像分析軟件進行定量分析。

1.5 統計學處理 應用SPSS 13.0對數據進行分析。對各組細胞增殖率、p-JNK及HSP70蛋白的表達行析因設計的方差分析,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組細胞增殖率、p-JNK及HSP70蛋白的表達比較 見圖1、2,表1～3。

表1 各組細胞增殖率比較(n=3) %

表2 各組細胞p-JNK水平比較(n=3)

3 討論

由于實體瘤瘤體中心血供較周邊差,中心多為乏氧細胞,對化療和放療不敏感,而對熱較敏感;相反瘤體外周血供較中心血供好,外周細胞對化療較熱療敏感,因此,熱療結合化療能更有效地殺傷腫瘤細胞,同時,熱化療聯合能增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用[5-6],逆轉腫瘤細胞的耐藥[7]。該研究結果顯示,熱療或化療單獨作用均可抑制細胞增殖,而熱化療聯合則有協同作用,與以上研究結果相符。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號轉導通路是細胞應激反應中主要的信號轉導途徑之一,與細胞的增殖分化密切相關。其中JNK是MAPKs中的重要組成之一,在細胞應激過程中被上級激酶MAPKKs磷酸化其Thr183和Tyr185 2個作用位點而被激活,并通過磷酸化以及功能性修飾它的分子靶標來調控多種細胞的生理功能,尤其在細胞生長增殖及凋亡方面有重要作用[8-9]。該研究中,熱療或化療單獨作用均可使p-JNK水平升高,而熱化療聯合則有協同作用,說明熱化療聯合對Raji細胞生長的抑制作用可能是通過 JNK信號轉導通路而發生的。

研究[10-12]顯示,加熱可以誘導 HSPs表達增加,導致細胞熱耐受能力的提高。HSP70家族是HSPs中最保守和最主要的一類,在細胞應激后生成最為顯著。該研究結果顯示,單純熱療或化療均使HSP70表達升高,而與單純熱療組相比,熱化療組HSP70表達降低,結合熱化療組細胞增殖率降低的結果,說明熱化療聯合的協同作用可能對抗了HSP70對腫瘤細胞的保護作用,從而更好地抑制了腫瘤細胞的生長。

綜上所述,熱化療聯合可抑制Raji細胞增殖,這種抑制作用可能是通過激活 JNK信號轉導通路或部分抑制HSP70蛋白的表達來完成。

[1]馬靜秋,梁輝,董戴玉,等.淋巴瘤骨髓侵犯臨床特點分析[J].臨床血液學雜志,2005,18(4):226

[2]張陽德,彭健.腫瘤治療新方法:熱療[J].中國現代醫學雜志,2003,13(10):43

[3]Kukoja-Taradi S,Taradi M,Andreis I.Thermotherapy of tumors[J].Lijec Vjesn,1994,116(3/4):102

[4]張洪新,劉燕,郭衛平,等.阿霉素加熱化療對人肝癌細胞耐藥模型-7721/Adm多藥耐藥性的影響[J].中華物理醫學與康復雜志,2000,12(6):366

[5]張繼賢,張啟昆,萬毅新.阿霉素熱化療誘導 A 549細胞凋亡及線粒體跨膜電位的變化[J].中國臨床藥理學與治療學,2004,9(6):662

[6]Hashimoto T,Shibata MA,Ito Y,et al.Elevated levels of intracelar Ca2+and apoptosis in human lung cancer cells give heat shock[J].Int J Hyperthermia,2003,19(2): 178

[7]王琳,楊繼要,吳逸明.熱化療對肺部腫瘤細胞生長影響的研究[J].環境與職業醫學,2007,24(2):201

[8]Johnson GL,Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathwaysmediated by ERK,JNK and p38 protein kinases [J].Science,2002,298(5 600):1 911

[9]Seger R,Krebs EG.The MAPK signaling cascade[J]. FASEB J,1995,9(9):726

[10]盧宏,王建平,劉春嶺,等.雌二醇預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織HSP70表達的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2005,40(4):639

[11]盛光輝.谷氨酰胺對胃癌患者術后血清白細胞介素-8和熱休克蛋白-70水平的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2009,44(4):822

[12]Lachapelle G,Radicioni SM,Stankiewicz AR,et al.Acute acidification or amiloride treatment suppresses theability of Hsp70 to inhibit heat-induced apoptosis[J].Apoptosis, 2007,12(8):1 479