骨髓間充質干細胞移植對肺氣腫大鼠的影響*

方 翔,湯兵祥,張曼林,孫 芳,胡建平,劉欣欣

1)鄭州大學第一附屬醫院呼吸科鄭州 450052 2)河南省胸科醫院呼吸科鄭州 450003

#通訊作者,男,1955年3月生,碩士,主任醫師,研究方向:呼吸疾病的基礎與臨床,E-mail:tangbingxiang01@sina.com

肺氣腫是多種肺部疾病病變過程中的一種病理表現,一旦發生病理改變將不可逆轉,最終導致肺功能的嚴重損害,給患者生活造成巨大影響。目前其治療手段有限,療效欠佳。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種具有多向分化潛能的干細胞,能分化為成骨細胞、軟骨細胞或肌細胞,甚至跨胚層界限分化為神經細胞或肝細胞等[1]。近 20年來其在現代醫學領域的應用備受矚目,相比之下其在肺部的應用僅屬初步階段。作者復制肺氣腫動物模型,進行MSCs移植,觀察移植效果,探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 脂多糖(LPS,Sigma公司),小鼠抗大鼠細胞角蛋白(CK)單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司),5-溴氮尿嘧啶核苷(Brdu,Sigma公司),抗Brdu單克隆抗體(Santa Cruz公司),Polymer雙染試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 大鼠M SCs的分離、培養和標記 無菌條件下分離大鼠雙側股骨,采集骨髓,貼壁法分離MSCs,接種于25 cm2塑料瓶,加L-DMEM及體積分數10%胎牛血清,于 37℃、體積分數 5%CO2孵育箱內培養,24 h后換液,去除未貼壁細胞,以后每 3～5 d換液1次,待細胞80%融合時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代,如此反復換液、消化,至第 7代細胞加入 10 mg/LBrdu進行標記,48 h后收集培養細胞,臺盼藍染色觀察細胞活力。

1.3 實驗動物及分組 Wistar大鼠30只,雄性,清潔級,編號SCXK(豫)2005-0001,體質量(180±10)g,6～8周齡,均購自河南省實驗動物中心。隨機數字表法分為3組:移植組、模型組和正常對照組,每組10只。

1.4 肺氣腫大鼠模型的建立和MSCs移植 實驗第 1天和第 14天,向模型組和移植組大鼠氣管內注入1 g/L LPS 200μL,向正常對照組大鼠氣管內注入生理鹽水 200μL,第 2～13天和第 15～35天將模型組和移植組大鼠置于自制熏箱內熏煙,1 h/d;對照組于普通環境下飼養,自由進食。第 36天移植組尾靜脈注入Brdu標記的MSCs細胞懸液0.5 mL,細胞數約5×106,余2組尾靜脈注入生理鹽水0.5mL。

1.5 觀測指標

1.5.1 病理檢查 移植30 d后統一處死全部大鼠,分離肺組織,生理鹽水沖洗肺腔后多聚甲醛固定,取右肺中下葉常規石蠟包埋,切片,HE染色,應用顯微-微機圖像處理系統,每張切片選擇 2個視野(×200),分別測量下列指標:①平均肺泡數(MAN)=每個視野內的肺泡數/該視野面積,其數值反映肺泡密度。②肺泡腔與肺總面積比(PAA):測量每個視野肺實質的灰度值,計算肺泡腔面積與肺總面積的比值,其數值反映肺泡大小。

1.5.2 MSCs檢測 取肺組織切片,采用即用型SP系列試劑盒,嚴格按其說明進行操作,DAB顯色,小鼠抗大鼠Brdu單克隆抗體稀釋濃度1:60。

1.5.3 CK檢測 取肺組織切片,免疫組織化學雙染色法檢測Brdu標記細胞中CK的表達情況,具體操作參考雙染試劑盒說明,先DAB顯色,再3-乙基-9-氨基咔唑(AEC)顯色。一抗分別為小鼠抗大鼠Brdu單克隆抗體(稀釋濃度1:60)和小鼠抗大鼠CK單克隆抗體(稀釋濃度1:100),二抗為生物素化山羊抗小鼠二抗工作液。陰性對照以PBS代替一抗。光鏡下觀察Brdu陽性信號呈紅色,CK陽性信號呈棕黃色。

1.6 統計學處理 采用SPSS 10.0處理數據,3組間MAN及PAA的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 MSCs的Brdu標記結果 在倒置顯微鏡下觀察,分離傳代后的MSCs呈均勻一致的梭形,第7代細胞經Brdu標記,免疫細胞化學染色顯示,陽性細胞核染成棕褐色,臺盼藍計數細胞活力達 90%,說明移植的細胞可靠性較高。

2.2 3組大鼠肺組織病理學改變 煙熏后 1周,模型大鼠開始出現食少、納差,毛發漸失去光澤、晦澀,神情倦怠,行走不穩,活動能力下降。HE染色后鏡下見:模型組和移植組大鼠肺組織呈慢性支氣管炎、肺氣腫樣改變,但移植組在炎性細胞浸潤、肺淤血等方面較模型組明顯減輕,與正常對照組相比仍有慢性支氣管炎及肺氣腫改變,見圖 1。3組 MAN及PAA測定結果見表1。

圖1 3組大鼠肺組織病理形態觀察(HE,×200)A:移植組;B:模型組;C:正常對照組。

表1 3組大鼠M AN及PAA測定結果

2.3 肺組織MSCs檢測 移植組大鼠肺組織切片中肺泡及支氣管壁的細胞胞核棕黃色著色,未移植MSCs的大鼠肺組織切片上則未見此染色,見圖 2。

圖2 Brdu標示的MSCs(SP,×400)A:正常對照組;B:移植組。

2.4 CK檢測結果 免疫組織化學雙染色結果顯示,移植組可見部分胞核棕黃色著色的細胞胞質同時染成紅色,而其他 2組肺組織切片中未見此種細胞染色,見圖 3。

圖3 CK檢測結果(免疫組織化學雙染色,×400)A:模型組;B:移植組。

3 討論

自從Gross等[2]發現木瓜蛋白酶滴入氣管內可誘發肺氣腫形成后,人們設計了許多肺氣腫動物模型用于研究。宋一平等[3]通過氣道內滴入 LPS加熏煙成功復制出肺氣腫大鼠模型。作者模仿該方法亦成功復制出肺氣腫大鼠模型。從外觀可見,模型大鼠毛色晦黯,活動減少,口腔分泌物增多,部分靜息時有喘息表現。肺組織病理切片可見大部分肺泡擴張融合,肺泡隔明顯增厚,肺泡直徑增大,其中可見炎性細胞浸潤,毛細血管擴張充血,外觀、病理改變都與人類肺氣腫十分相似。MSCs移植組大鼠肺部炎癥較模型組明顯減輕,病理形態學指標也較其明顯好轉,說明MSCs移植對肺氣腫大鼠有積極影響。

MSCs移植之所以能夠使LPS加熏煙所致肺氣腫模型大鼠肺部炎癥及病理得到改善,可能與移植的MSCs在肺內的定植及分化為肺泡細胞有關。有研究者[4-5]用全骨髓移植的方法得到肺泡Ⅱ型細胞、肺泡Ⅰ型細胞及成纖維細胞。研究表明MSCs可以分化為肺泡細胞。Krause等[6]將標記的雄性小鼠骨髓干細胞注入經放射線照射后的雌性小鼠體內,得到了一組濃聚的長周期更新細胞,48 h后這些細胞返回骨髓(歸巢);取出這些細胞并稀釋,在保證每只雌性小鼠只獲得單一雄性小鼠骨髓細胞的前提下,注入到第 2批雌性受鼠體內;11個月后通過鑒定Y染色體和上皮細胞特異性標志物 CK的表達,證實供體干細胞分化的組織細胞存在,包括超過20%表達角蛋白和表面活性物質 B的肺泡Ⅱ型細胞以及不到4%的氣管上皮細胞為Y染色體陽性。Rojas等[7]將MSCs移植到博萊霉素誘導的肺損傷小鼠體內,發現輸入體內的MSCs定向遷移到肺損傷區域,分化為特定的細胞表型,包括Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞。作者發現,移植大鼠肺內可檢測到經過Brdu標記的MSCs,并且部分Brdu陽性細胞亦表達CK,說明移植的MSCs在肺內分化為了上皮細胞。這可能是肺氣腫得到改善的原因,但作者未對上皮細胞表型進行確認。

[1]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,etal.Multilineage potential of adu lt human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5 411):143

[2]Gross P,Pfitzer EA,Tolker E,etal.Experimentalemphysema:its production with papain in normal and silicotic rats [J].Arch Envrion Health,1965,11:50

[3]宋一平,崔德健,茅培英,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及藥物干預的影響[J].中華內科雜志,2000, 39(9):556

[4]Grove JE,Lutzko C,Priller J,et al.Marrow-derived cell as vehicles for delivery of gene therapy to pu lmonary epithelium[J].Am JRespir Cell Mol Biol,2002,27(6):645

[5]Abe S,Lauby G,Boyer C,et al.Transplanted BM and BM side population cells contribute progeny to the lung and liver in irradiated mice[J].Cytotherapy,2003,5(6):523

[6]Krause DS,Theise ND,Collector MI,et al.Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell[J].Cell,2001,105(3):369

[7]Rojas M,Xu J,Woods CR,etal.Bonemarrow-derivedmesenchymal stem cells in repair of the in jured lung[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,33(2):145