河南漢族缺血性腦血管病患者胱硫醚 β-合成酶基因 T27796C多態性檢測*

路 燕,滕軍放

鄭州大學第一附屬醫院神經內科鄭州 450052

#通訊作者,男,1960年11月生,本科,主任醫師,教授,研究方向:腦血管病防治及睡眠障礙治療,E-mail:tjf.6666@yahoo.com.cn

近年來缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)的病因及發病機制研究已取得很大的進展,高同型半胱氨酸血癥(HHcy)也被認為是ICVD的獨立危險因素之一,而引起同型半胱氨酸(Hcy)升高的主要因素是其相關代謝酶的輔酶維生素缺乏。已發現亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR) C677T基因突變可引起血漿 Hcy水平升高,導致腦血管疾病的發生[1]。胱硫醚-β合成酶 (CBS) 844ins68基因多態性可造成CBS缺陷,引起重度HHcy及過早動脈粥樣硬化,從而導致血管內多發血栓形成[2]。CBST833C基因突變與缺血性腦卒中存在關聯,可能是缺血性腦卒中的遺傳危險因素[3]。作者采用病例-對照研究探討 CBS T27796C基因位點多態性與ICVD的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 92例ICVD患者(病例組)和52例對照(對照組)來自 2008年 12月至2009年 4月鄭州大學第一附屬醫院神經內科住院患者及門診體檢者,均為河南漢族人。病例組符合 1995年第 4屆全國腦血管病學術會議修訂的急性 ICVD的診斷標準,并經頭顱CT和(或)MRI檢查確診;對照組為無ICVD病史、無臨床血管事件發生的神經內科其他住院患者及健康體檢者。2組均排除腦出血、蛛網膜下腔出血等出血性腦血管疾病,均無帕金森病、癡呆、甲狀腺、肝臟及腎臟疾病及服用葉酸、維生素 B12及美多芭等藥物史。病例組 92例,男 68例,女 24例,年齡 39～86歲。對照組52例,男35例,女 17例,年齡 39～87歲。2組性別及年齡分布差異均無統計學意義(χ2=0.712,P=0.399;t=1.548,P=0.124)。1.2 CBST 27796C基因多態性檢測 采用多聚酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法。取EDTA抗凝靜脈血2 m L,采用CBM公司基因提取試劑盒提取人全血基因組DNA。參照文獻[4]設計引物,上游引物5'-ACAATCAGCGGCATTTAGTA-3',下游引物5'-ACAGAGACACAAAGTCGATC-3',擴增產物大小為176 bp。PCR反應體系為30μL: PCRMagic Mix 2.0酶(CBM公司)15μL,上、下游

引物(10μmol/L)各2.0μL,模板DNA 2.0μL, ddH2O補至30μL。PCR擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性40 s,55℃復性40 s,72℃延伸90 s,循環34次;72℃延伸10 min。PCR產物經25 g/L瓊脂糖凝膠電泳,EB染色檢驗擴增結果。酶切反應體系為30μL:PCR擴增產物10μL,HpaⅡ2.0μL, 10×Buffer Tango 2.0μL,ddH2O 16μL。酶切產物在37℃水浴箱中溫浴3 h,經30 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,EB染色,紫外凝膠成像儀下觀察帶型并照相。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS 16.0處理。對2組基因型和等位基因頻率分布差異行 χ2檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 2組CBS T27796C基因型頻率的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(病例組 χ2=2.938,對照組 χ2=2.848, P均 ＞0.05)。2組樣本有群體代表性。

2.2 2組CBS T27796C基因型及等位基因頻率分布 見表1。T/T野生型與C/C純合子基因頻率及C等位基因分布頻率差異有統計學意義,T/T野生型與C/T純合子基因型頻率差異無統計學意義。

表1 2組CBS T27796C基因型及等位基因頻率分布 例(%)

2.3 PCR-RFLP檢測結果 PCR擴增產物經HpaⅡ酶切后,共有3種基因型:野生型(T/T型)只有176 bp;雜合子突變型(C/T型)有176、100和76 bp 3個片段;純合子突變型(C/C型)有100和76 bp 2個片段。CBS基因T27796C酶切產物見圖1。

圖1 PCR-RFLP產物電泳圖M:DNA Marker;1,2,4,6,10:C/C型;3,5,8:T/T型;7,9:C/T型。

3 討論

人類CBS基因位于 21q22-3染色體上,全長28 046 bp,可編碼 551個氨基酸。Kraus等[5]通過基因組序列分析發現人類CBS基因含有23個外顯子,片段長度從42 bp到299 bp不等。目前已發現CBS基因上至少存在著 80個位點突變,多為單位點突變,且均為單一型,多分布于第 3和第 8外顯子上。CBS基因所編碼的蛋白CBS是人體內Hcy代謝的關鍵酶,人體內約一半Hcy通過CBS和胱硫醚裂解酶不可逆地生成半胱氨酸;另一半則通過再甲基化形成蛋氨酸。此外,Hcy與半胱氨酸形成二硫化合物,使Hcy釋放于細胞外亦主要受CBS的影響[6]。

該研究結果顯示,病例組和對照組 CBS T27796C C等位基因頻率與 C/C基因型頻率差異均有統計學意義,提示CBST27796C基因純合子突變型可能與河南漢族人ICVD的發生有關,可能是ICVD的遺傳影響因素之一。這與國內報道[6]結果不一致,分析原因可能如下:①入選病例的排除標準不同、各種缺血性腦卒中所占比例不同及所選樣本量不同均可能造成研究結果不一致。②即使是同一種族在不同地區的基因突變率也可能不同,造成其遺傳易感性不同。③該研究所涉及的樣本量仍然相對較少,病例-對照研究所產生的偏倚也可能對研究結果產生影響。

該研究結果對于進一步了解ICVD的發病機制及遺傳影響因素有一定的參考意義,但因CBS基因上有數十個突變位點,因此不能否認CBS為ICVD的易感基因,有待于進一步在不同地區進行大樣本、多中心研究。

[1]Zhang G,Dai C.Correlation analysis between plasma homocysteine level and polymorphism of homocysteinemetabolism related enzymes in ischemic cerebrovascu lar or cardiovascu lar diseases[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 2002,23(3):126

[2]Robert K,Chasse JF,Santiard-Bazon D,et al.Altered gene exp ression in liver from a murine model of hyperhomocysteinemia[J].JBiol Chem,2003,278(34):31 504

[3]Wu JM,Wang TG,LiYQ,et al.Genetic mutations ofhomocysteinemetabolism related enzymes in patients with ischem ic stroke[J].YiChuan,2004,26(3):298

[4]傅毅,劉建榮,倪培華,等.同型半胱氨酸及代謝酶基因多態性與腦卒中的相關性研究[J].中華老年醫學雜志,2005,24(6):413

[5]Kraus JP,Oliveriusova J,Sokolova J,et al.The human cystathionineβ-synthase(CBS)gene:complete sequence, alternative splicing,and polymorphisms[J].Genomics, 1998,52(3):312

[6]方樂,鄔巍,鄔英全,胱硫醚 β-合成酶基因多態性與腦卒中相關性的研究[J].中國危重病急救醫學,2004,16 (3):161