氯化錳對大鼠睪丸間質細胞睪酮合成及去勢大鼠生殖內分泌的影響*

高慧艷,李春陽,蘇曉東,尚平平,陳小玉#

1)鄭州大學公共衛生學院衛生毒理學教研室鄭州 450001 2)鄭州煙草研究院鄭州 450001

#通訊作者,女,1957年11月生,碩士,教授,研究方向:生殖與發育毒理,E-mail:chen-xiaoyu@zzu.edu.cn

錳是人體的一種必需微量元素,但是過量的錳可對人的神經系統、免疫系統和生殖系統產生毒害作用。過去人們對錳毒性的研究多集中在神經系統方面,近年來隨著生殖毒理、生殖流行病學和生殖生化領域研究的發展,錳對雄性生殖系統的損害日益受到關注。研究[1-2]顯示,錳對多種雄性動物生殖系統有損害作用。作者觀察了氯化錳對大鼠體外培養的睪丸間質細胞(leydig細胞)睪酮合成的影響及氯化錳對雄激素依賴組織、血清睪酮(testosterone,T)和前列腺特異抗原(prostate specific antigen,PSA)水平的影響,以觀察錳的抗雄激素樣作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:成年雄性健康SD大鼠,體質量(220±20)g,由河南省實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(豫)2005-0001,動物級別二級。②主要試劑:氯化錳(分析純),天津瑞金特化學品有限公司提供;氟他胺,江蘇天士力帝益藥業有限公司提供;丙酸睪酮(TP)注射液,上海通用藥業股份有限公司提供;F12培養基、DMEM培養基、臺盼藍以及Ⅱ型膠原酶均購于Sigma公司;人絨毛膜促性腺激素(HCG)購于上海第一生化藥業公司;Percoll分離液購于Phanacia公司;T檢測試劑盒購于北京北方生物技術研究所;125I-PSA免疫放射分析試劑盒購于北京科美東雅生物技術有限公司。

1.2 leydig細胞的分離及純化 參照文獻[3-4]的方法,并適當改進。

1.3 不同濃度的氯化錳對leydig細胞存活率的影響 用DMEM/F12培養基將leydig細胞密度調整至1.0×105mL-1,接種于24孔板,培養 24 h后,更換為含 1.0×10-6、2.5×10-6、5.0×10-6、1.0× 10-5、2.5×10-5、5.0×10-5和 1.0×10-4mol/L氯化錳的培養基,每個劑量設 6個復孔,并設對照組,繼續培養。24 h后,臺盼藍染色計算細胞存活率。實驗重復3次。

1.4 基礎狀態和HCG刺激下氯化錳對leydig細胞T分泌的影響 leydig細胞接種于24孔板培養24 h后,分別更換為加和不加10.0 kU/L HCG的含1.0×10-6、2.5×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5、2.5× 10-5、5.0×10-5與1.0×10-4mol/L氯化錳的培養基,每個劑量設 6個復孔,并設對照組,繼續培養。24 h后,采用放射免疫法測定 T含量。實驗重復3次。

1.5 各組去勢大鼠血清T與PSA水平及雄激素依賴組織臟器系數測定 SD大鼠適應實驗環境 1周后,腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉,麻醉完全后行睪丸摘除術,7 d后隨機分為6組(每組10只):溶劑對照組皮下注射玉米油0.2m L;陰性對照組皮下注射TP 1.0μg;氯化錳低、中、高劑量組在皮下注射1.0μg TP后,分別腹腔注射氯化錳7.5、15.0和30.0 mg/kg;陽性對照組在皮下注射1.0μg TP后,腹腔注射氟他胺100.0mg/kg,1次/d,連續7 d。于末次給藥后24 h,稱取質量,用戊巴比妥鈉麻醉后股動脈采血,分離血清,采用放射免疫法分別測定 T和PSA含量;采血后處死動物,迅速剝離雄激素依賴組織腹側前列腺、精囊腺、尿道球腺、肛提肌和球海綿體肌(LABC肌)等,剔除周圍結締組織和脂肪,吸干表面血漬,于萬分之一天平上稱量以上剝離組織的濕質量,計算臟器系數,臟器系數 =臟器濕質量/大鼠體質量。

1.6 統計學處理 應用SPSS 13.0對各組leydig細胞存活率、基礎狀態及HCG刺激下 T分泌水平、各組大鼠血清T和PSA水平及雄激素依賴組織的臟器系數行單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組leydig細胞存活率及T分泌水平比較見表1。

表1 各組leydig細胞存活率及T分泌水平比較(n=3)

2.2 各組去勢大鼠血清T與PSA水平及雄激素依賴組織臟器系數比較 見表2。

表2 各組去勢大鼠血清T與PSA水平及雄激素依賴組織臟器系數比較(n=10)

3 討論

睪丸leydig細胞的主要功能是合成和分泌T,并受黃體生成素(LH)調控。體外培養的leydig細胞不存在體內相互作用的環境,失去了促性腺激素的節律性刺激作用,分泌雄激素的量大大減少。HCG與LH有相同的受體結構,可替代體內LH的作用刺激 leydig細胞合成 T[5]。因此,作者采用HCG刺激leydig細胞分泌T。研究結果顯示,無論是在基礎狀態還是HCG刺激狀態下,隨氯化錳染毒劑量的升高,leydig細胞分泌T呈下降趨勢,說明氯化錳可抑制體外培養的leydig細胞合成T,原因可能是錳影響了 T合成過程中各種酶的功能[6],從而導致leydig細胞分泌T能力的下降。另一方面,隨著氯化錳劑量的升高,leydig細胞存活率下降,故不排除氯化錳對leydig細胞的直接影響導致T分泌能力的下降。

Hershberger實驗是最常用的篩檢環境抗雄激素物質的體內短期實驗方法,敏感而迅速[7]。該研究Hershberger實驗結果顯示,染毒組去勢大鼠血清T與PSA水平均高于陽性對照組,但與陰性對照組比較,差異無統計學意義,可能是氯化錳對外源性激素水平的影響不敏感。此外,高劑量氯化錳可使去勢大鼠的雄激素依賴組織腹側前列腺及精囊腺的臟器系數減小,提示腹側前列腺及精囊腺對氯化錳的雄激素抑制作用較敏感,在血清激素水平變化微弱的情況下,雄激素依賴組織依然對氯化錳的抑制作用表現明顯,說明錳可能有拮抗雄激素的作用。

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[6]孫佳音,應鋒,韓曉冬.睪丸間質細胞中睪酮合成酶及蛋白表達的調控因子[J].生殖與避孕,2009,29(1):42

[7]Charles GD,Kan HL,Schisler MR,et al.A comparison of in vitro and in vivo EDSTAC test battery results for detecting antiandrogenic activity[J].Toxicol Appl Pharmacol, 2005,202(1):108