胰腺癌組織中P21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表達

趙 燕,姚志華,馬 杰,劉艷艷,楊樹軍#,劉 濤

1)河南省腫瘤醫院內科鄭州 450008 2)河南省腫瘤醫院病理科鄭州 450008 #通訊作者,男,1965年1月生,本科,主任醫師,研究方向:惡性腫瘤

由于缺乏典型的臨床癥狀及靈敏的檢測手段,絕大部分胰腺癌患者就診時已屬晚期,失去手術機會,5 a生存率僅為 1%～5%[1]。異常的信號傳導通路是多數腫瘤發生發展的主要機制之一。P21ras蛋白為重要的信號轉導物,轉化生長因子-α(transforming growth factor-alpha,TGF-α)及表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)為生長信號的發放者。作者利用免疫組織化學法檢測 3種蛋白在胰腺癌組織中的表達情況,探討其與胰腺癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河南省腫瘤醫院 2001年3月至2007年 7月普通外科手術切除并經病理確診的原發性胰腺導管腺癌標本 30例,患者男 20例,女 10例,年齡 30～76歲;胰頭部癌 25例,其他部位癌 5例;按國際抗癌聯盟(UICC)胰腺癌(1987)病理分級標準,高、中分化癌21例,低分化癌9例;按UICC胰腺癌 TNM分期系統,Ⅰ～Ⅱ期 16例,Ⅲ～Ⅳ期14例;有淋巴結轉移 13例,無淋巴結轉移 17例。患者術前均未接受化療和放療。以該院手術切除的胰腺良性病變標本中的正常胰腺組織 10例作對照。1.2 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白檢測 采用免疫組化SP法檢測。鼠抗人P21ras單克隆抗體、鼠抗人TGF-α單克隆抗體及兔抗人EGFR多克隆抗體均購于美國Santa Cruz公司,抗體稀釋度1:50;超敏SP(廣譜)試劑盒及DAB試劑盒購于福州邁新生物技術開發公司。標本石蠟包埋,4μm厚切片,二甲苯脫蠟,乙醇梯度水化,體積分數 3%H2O2甲醇溶液消除內源性過氧化物酶,高壓水煮修復抗原,滴加一抗4℃過夜,PBS漂洗,依次滴加生物素標記的二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶,DAB顯色,蘇木素復染。用已知的陽性切片作陽性對照,以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定標準[2-3]高倍鏡(×400)下選取 5個視野進行觀察,每個視野觀察細胞不少于 200個。P21ras蛋白:以胞質出現棕黃色顆粒且著色細胞數≥5%為陽性表達。TGF-α:以胞質和(或)胞核出現棕黃色顆粒且著色細胞數≥10%為陽性表達。EGFR:以胞質出現棕黃色顆粒和(或)胞膜出現棕黃色染色且著色細胞數≥20%為陽性表達。

1.4 統計學處理 應用SPSS 15.0進行統計處理,胰腺癌與正常組織 3種蛋白表達的差異及不同臨床病理特征胰腺癌組織中 3種蛋白表達的差異采用確切概率法分析,對胰腺癌組織中TGF-α與EGFR蛋白表達的關系進行關聯性分析,計算列聯系數,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白檢測結果 見圖1、表1。胰腺癌組織中P21ras的表達不均勻且異質性明顯,呈局灶性或彌漫性分布;正常胰腺組織中僅個別表達,且呈局灶性分布。胰腺癌組織中TGF-α及EGFR均呈彌漫性表達,正常胰腺組織中TGF-α及EGFR僅個別病例呈局灶性表達或不表達。3種蛋白在胰腺癌組織中的表達水平均高于正常胰腺組織。

圖1 正常胰腺及胰腺癌組織中P21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表達(SP,×400)A 1,A 2:胰腺癌及正常胰腺組織中P21ras蛋白的表達;B 1,B2:胰腺癌及正常胰腺組織中TGF-α蛋白的表達;C 1,C2:胰腺癌及正常胰腺組織中EGFR蛋白的表達。

表1 胰腺正常及癌組織中P 21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表達例(%)

2.2 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 見表2。由表2可知,P21ras蛋白的表達與胰腺癌的病理分級、臨床分期及淋巴結轉移有關,TGF-α、EGFR與胰腺癌的病理分級、臨床分期及淋巴結轉移無關。

2.3 胰腺癌組織中TGF-α及EGFR表達的關聯性分析 見表3。

表2 P 21ras、TGF-α及EGFR表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 陽性例數(%)

表3 胰腺癌中TGF-α與EGFR表達的關聯性分析 例

3 討論

細胞發生癌變主要由于兩方面的異常:一方面為胞外和(或)胞內控制細胞生長增殖的信號增多,如生長因子及生長因子受體過表達;另一方面為細胞增殖信號從細胞表面向核內傳導過程中,某個或某些環節如信號轉導物、蛋白激酶及轉錄激活物發生改變,使細胞生長失去正常生理信號的調控,從而產生腫瘤的各種生物學和病理學特征。

研究[4]顯示,90%的胰腺癌患者存在k-ras基因突變,k-ras基因通過在 12、13或 61位密碼子的突變而大量活化,造成其編碼蛋白 P21ras大量表達,同時也使P21ras蛋白的空間構型和功能發生改變,使P21ras蛋白處于持續活化狀態,不斷向下游發放生長信號,從而改變了正常細胞的生長與調控,使細胞進入增殖周期,阻止細胞發生分化。反義k-ras基因可下調k-rasmRNA和P21蛋白表達,從而抑制胰腺癌細胞的增生并促進凋亡,說明P21ras蛋白大量表達參與了胰腺癌的發生與發展[5]。作者的研究結果顯示,胰腺癌組織中P21ras蛋白的表達高于正常胰腺組織,且在高、中分化、Ⅰ ～Ⅱ期及無淋巴結轉移癌組織中的表達高于低分化、Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結轉移的癌組織,與李淑德等[6]結果一致,提示P21ras蛋白的表達是胰腺癌一早期而普遍的事件,檢測P21ras蛋白有助于胰腺癌的早期診斷。

TGF-α是一類在腫瘤的發生發展中起關鍵作用的生長因子,它能夠與EGF競爭,與EGFR結合,激活EGFR胞內區的酪氨酸激酶,繼而催化其下游的靶蛋白的磷酸化,從而將細胞外信號傳遞到細胞內,最終促進靶細胞的 DNA合成及有絲分裂。利用化學致癌劑誘導的大鼠胰腺導管腺癌[7]及人胰腺導管腺癌[8]組織中均可發現TGF-α及EGFR的過表達。作者的研究結果顯示,TGF-α與EGFR在胰腺癌組織中高表達,但 2者的表達與胰腺癌的病理分級、臨床分期及淋巴結轉移無關;胰腺癌組織中 2者的表達密切關聯。Pina等[9]將EGFR抑制劑應用于胰腺癌細胞系,發現癌細胞增殖抑制與凋亡的程度與TGF-α密切相關。許雅等[10]利用反義TGF-α及反義EGFR轉染胰腺癌PC-7細胞系構建穩定的雙重轉化細胞系,結果雙重轉化細胞系細胞更容易發生凋亡。上述研究結果均提示,TGF-α及EGFR參與了胰腺癌的形成,TGF-α/EGFR形成的自分泌環是胰腺癌形成的重要機制。

靶向性藥物是目前抗癌藥物研究的熱點,胰腺癌分子靶向藥物的研究主要集中于單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑以及腫瘤疫苗等[11],尤其是針對EGFR的cetuximab及酪氨酸激酶抑制劑erlotinib[12-14]。作者的研究結果顯示P21ras、TGF-α及EGFR有可能成為胰腺癌藥物治療的靶點,為靶向藥物的應用提供了理論基礎。

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