雷公藤多糖甙對大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響

方 莉,李慶軍,方樹友

1)鄭州大學醫院檢驗科鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院神經內科鄭州 450052△女,1969年3月生,本科,主管技師,研究方向:神經疾病,E-mail:qrsy327@163.com

腦缺血/再灌注損傷機制迄今尚未完全闡明。近年研究[1]表明,TNF-α在缺血性腦血管病中起重要作用。腦缺血誘導的細胞因子如腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factorα,TNF-α)等表達在腦炎癥反應中起重要作用。雷公藤多糖甙(multi-glycosides of tripterygium wilfordii Hook F.,GTW)為雷公藤(tripterygium wilfordii Hook F.,TWHF)提取物,含有多種活性成分。體外實驗[1]表明 GTW可抑制TNF-α的產生。作者建立了大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型,觀察GTW對血清TNF-α水平的影響,探討腦血管病的發病機制及GTW的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 健康Wistar大鼠132只,雌雄不限,體質量 250～300 g,由河南省實驗動物中心提供。GTW:10mg購自湖南株州市制藥三廠出品,批號20070302。TNF-α放射免疫分析藥盒購自北京北免東雅公司。

1.2 動物模型的建立 大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型參照Longa等[3]方法建立,大鼠清醒后,觀察大鼠的體征,出現以下體征者表明模型的制作成功:①左側Homer's征。②右前肢癱瘓,將鼠尾提起,大鼠不能充分伸展右前肢;當動物右旋時其右前肢拖在腹下,與左前肢交叉成剪刀狀;當左旋時,其右前肢掌面向上,被拖在身體的右側。無上述體征者舍棄。

1.3 實驗分組 大鼠 132只,隨機分為4組,每組33只:Ⅰ組為假手術組,進行手術操作,但不穿線;Ⅱ組為手術組,即腦缺血/再灌注損傷組;Ⅲ組為腦缺血/再灌注損傷+生理鹽水治療組;Ⅳ組為腦缺血/再灌注損傷+GTW治療組。Ⅳ組于實驗前3 d開始灌胃給藥,GTW量為30mg/kg,每天2次,術前1 h加灌 1次。Ⅲ組給予等體積生理鹽水。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組及Ⅳ組分別于 1、3、6、12及 24 h時間點處死,每時間點6只,留取血清用放免法測定TNF-α含量。缺血 1 h/再灌注 24 h后每組斷頭處死每組 3只大鼠,取腦制作病理組織切片,HE染色后觀察。

1.4 統計學處理 采用SPSS 10.0對各組大鼠不同時間點血清TNF-α含量進行單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后病理改變 Ⅰ組無梗死灶,神經元結構、形態正常,無間質水腫(圖1A);Ⅱ組(圖1B)和Ⅲ組(圖1C)呈點狀壞死,神經元胞體縮小,變形、核固縮,胞漿濃縮呈深伊紅染色,間質水腫明顯(神經元纖維疏松,神經元、膠質細胞以及血管周圍腔隙增大)。Ⅳ組多數神經元結構較完整,形態相對正常,間質水腫明顯減輕(圖1D)。

2.2 不同的再灌注時間各組大鼠血清中TNF-α的變化 見表1。

圖1 各組大鼠腦組織病理形態(HE,×400)A,B,C,D:分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ組。

表1 不同的再灌注時間各組大鼠血清中TNF-α的變化(n=6) μg/L

3 討論

Liu等[4]觀察到在缺血后 1 h缺血側神經元即有TNF-αmRNA的表達,12 h達高峰。該實驗結果顯示,在大鼠腦缺血1 h/再灌注3 h時TNF-α濃度開始升高,6 h達高峰,隨后下降,但 24 h仍高于假手術組,提示腦缺血/再灌注過程中TNF-α合成增加。

TNF-α對神經元無直接毒性,而是通過廣泛的間接途徑產生繼發性損傷[5-7],誘導和刺激包括炎癥介質、細胞壞死及凋亡相關因子在內的急性期蛋白分泌;參與并促進腦缺血急性期“瀑布效應”,刺激興奮性氨基酸的釋放,促進腦缺血后NMDA受體的激活及鈣超載損傷的級聯效應,激活核因子NF-κB調節黏附分子、細胞因子和化學因子的合成和分泌,影響膠質細胞、基質金屬蛋白酶表達和破壞細胞間通信,惡化腦缺血后內環境紊亂和組織損傷,觸發多種凋亡機制,介導神經元的凋亡,因此,下調TNF-α水平可以改善腦缺血的預后。

作為抗炎藥物GTW能明顯抑制TNF-α的產生。體外實驗[8]證實TWHF能明顯抑制單核巨噬細胞、淋巴細胞分泌 TNF-α。在某些炎癥性動物模型研究[9]中發現,TWHF能明顯降低這些模型中炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β等的濃度,減輕炎癥反應,促進機體恢復。該實驗中也有類似發現,大鼠腦缺血再灌注損傷后,GTW可以降低再灌注3～24 h時的血清 TNF-α的水平,Ⅳ組為腦缺血/再灌注損傷后30mg/kg雷公藤多糖甙治療組,結果表明多數神經元結構較完整,形態相對正常,間質水腫明顯減輕。該研究提示 GTW可以減輕腦缺血/再灌注后炎癥反應,從而減輕腦缺血/再灌注損傷,對腦缺血/再灌注損傷有保護作用。

[1]Lamberten KL,Clausen BH,Babcock AA,et al.Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrbsis factor[J].JNeurosci,2009,29(5):1 319

[2]Chang DM,ChangWY,Kuo SY,etal.The effects of traditional antirheumatic herbal medicines on immune response cells[J].JRheumatol,1997,24(3):436

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J].Stroke,1989,20(1):84

[4]Liu T,Clark RK,McDonnell PC,et al.Tumor necrosis factor-alphaexp ression in ischem ia neurons[J].Stroke,1994, 25(7):1 481

[5]Gong C,Qin Z,Betz AL,etal.Cellular localixation of tumor necrosis factor alpha followng focal cerbral ischcm ia in m ice brain res[J],1998,801(1/2):1

[6]Uno H,Mastsuyam T,Akita H,et al.Induction of tumor necrosis factor-alpha in the mouse hippocampus following transient forebrain ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,1997,17(5):491

[7]Zera T,Ufnal M,Szczepanska-Sadowska E.Central TNF-alpha elevates blood pressureand sensitizes to central pressor action of angiotensinⅡin the infarcted rats[J].J Physiol Pharmacol,2008,59(8):117

[8]Nijboer CH,Heijnen CJ,Groenendaal F,et al.Alternate pathways preserve tumor necrosis factor-alpha p roduction after nuclear factor-kappa B Inhibition in neonatal cerebral hypoxia-ischemia[J].Stroke,2009,40(10):3 362

[9]Adibhatla RM,Hatcher JF.Secretory phospholipase A 2ⅡA is up-regulated by TNF-alpha and IL-1alpha/beta after transient focal cerebral ischemia in rat[J].Brain Res, 2007,1 134(1):199