微生物源類胡蘿卜素研究進展

趙 婷，林孔亮，惠伯棣*

(北京聯合大學應用文理學院，北京 100191)

微生物源類胡蘿卜素研究進展

趙 婷，林孔亮，惠伯棣*

(北京聯合大學應用文理學院，北京 100191)

類胡蘿卜素對人類身體健康的重要性日益受到人們關注，越來越多的類胡蘿卜素功能食品走進市場。為滿足人們對類胡蘿卜素日益增長的需要，成本低、純度高、更加安全的微生物源類胡蘿卜素產品有逐漸替代化學合成和植物提取產品的趨勢。本文對類胡蘿卜素在微生物中的分布、資源、生產技術和市場潛力進行綜述，為更有效地利用微生物中的類胡蘿卜素資源，研發相應的生產技術，向市場提供更安全、質量更好的類胡蘿卜素產品提供參考。

類胡蘿卜素；微生物；微藻；轉基因

大量的動物和人體血液及組織分析結果表明，人體內含有豐富的類胡蘿卜素(carotenoid)。這些化合物與人體健康和降低疾病風險有關，例如控制前列腺疾病和退行性黃斑衰退癥等疾病[1-2]。因此，人類需要通過食物來補充類胡蘿卜素，以保證健康。但所有動物都不能自身合成類胡蘿卜素，人類體內也不能合成類胡蘿卜素，只能通過攝食含有類胡蘿卜素的植物及低等生物或生物富集而獲得類胡蘿卜素。微生物作為地球上出現最早的生物，在類胡蘿卜素富集的整個生物鏈中起著重要的作用。

幾十年來，類胡蘿卜素在商業上的生產，通常是利用化學合成法或從高等植物中提取，例如從番茄和紅辣椒中提取的番茄紅素(l y c o p e n e)和辣椒紅素(capsanthin)。在自然界中，有些單細胞綠藻在一定條件下，由于高濃度次生代謝產物——類胡蘿卜素的積累會變紅。例如，杜氏藻(Dunaliella salina)和雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)中存在著豐富的β-胡蘿卜素(β-carotene)和蝦青素(astaxanthin)(圖1)。

圖1 β-胡蘿卜素(a)和蝦青素(b)的分子結構Fig.1 The molecular structures ofβ-carotene (a) and axtaxanthin (b)

大量的類胡蘿卜素能夠在細菌(bacteria)、酵母

(yeast)和霉菌(mould)等微生物中積累，所以這些微生物有很大的商業應用前景。在食品產業中，利用發酵獲得的原料成分逐年增加。例如：增稠或膠凝劑(黃原膠、凝膠多糖、凝膠糖等)、香味劑(酵母水解物、谷氨酸鈉等)、風味化合物(γ-癸內酯、丁二酮、甲酮等)和酸化劑(乳酸、檸檬酸等)等的生產[3]。發酵技術也已經大規模地用于著色劑的生產。目前有些產品已在食品產業中大量應用。例如：在歐洲，利用三孢布拉霉(Blakeslea trispora)生產β-胡蘿卜素和番茄紅素；在亞洲，利用紅曲霉(Monascus purpureus Went)生產開環類胡蘿卜素[4-5]。應用發酵法生產食品著色劑降低了產品的生產成本，與合成色素或植物提取物相比，發酵產品具有較強的市場競爭力。如果能發現或篩選出新的微生物物種，可以進一步降低類胡蘿卜素產品的成本。

微生物源的類胡蘿卜素產品已經可以被用作食品或飼料色素添加劑，目前正在討論將其作為功能性食品使用的可能性[6]。本文對類胡蘿卜素在微生物中的分布、資源、生產技術和市場潛力進行綜述，為更有效地利用微生物中的類胡蘿卜素資源，研發相應的生產技術，向市場提供更安全、質量更好的類胡蘿卜素產品提供參考。

1 利用微生物生產類胡蘿卜素

在現代微生物概念的范疇內，目前至少有從微藻(microalgae)、霉菌、酵母和細菌中生產類胡蘿卜素產品的工業化實踐的報道。尤其是從微生物中生產β-胡蘿卜素的技術已經相當成熟。從微生物中生產的其他類胡蘿卜素包括：番茄紅素、蝦青素、玉米黃質(zeaxanthin)和角黃質(canthaxanthin)。它們的分子結構見圖1～2。

圖2 番茄紅素(a)、玉米黃質(b)和角黃質(c)的分子結構Fig.2 The molecular structures of lycopene (a), zeaxanthin (b) and canthaxanthin (c)

1.1 β-胡蘿卜素

目前大規模生產β-胡蘿卜素的方法主要有化學合成法和植物資源(如紅棕櫚油)提取法[7]。近20年來，微生物發酵法也已初具規模。在這一領域，首先應當關注的是：不同的生產方法會造成產品質量上的差異。這一差異主要集中在兩個方面：1)β-胡蘿卜素幾何異構體組成上的差異；2)類胡蘿卜素組成上的差異，尤其是生物合成中間體組成上的差異。具體差異比較見表1[8]。

表1 不同來源β-胡蘿卜素產品的類胡蘿卜素組成Table 1 Composition ofβ-carotene products from different sources

1.1.1 杜氏藻

雖然藍藻屬中的螺旋藻能夠在體內積累數量可觀的β-胡蘿卜素(0.8～1.0g/100g干基)，但在生產上多采用微藻中的杜氏藻(Dunaliella salina，又名鹽生杜氏藻)生產β-胡蘿卜素。

杜氏藻是一種耐鹽單細胞游動的綠藻，屬于綠藻綱[9]。與高等植物相比具有簡單快速地培養優勢。在適宜的條件下，杜氏藻與其他β-胡蘿卜素源相比具有很高的含量(3～5g/100g干基)，產量亦可觀(400mg/m3)[10]。

杜氏藻細胞沒有堅硬的細胞壁，具有杯狀葉綠體，與高等植物的葉綠體相似。其生長在高鹽濃度環境中，需要碳酸氫鹽作為碳源。同時，還需要硝酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽等其他營養物質。最初的光合生長階段需要12～14d，需要在富含硝酸鹽的培養基中；隨后的類胡蘿卜素形成階段需要消耗硝酸鹽，因此必須維持其鹽度。杜氏藻最適合生長在富含鹽和其他營養物質的沿海區域。在類胡蘿卜素合成階段中，營養物質、鹽度或光的脅迫是必須滿足的條件。

在最初的光合生長階段，杜氏藻需要5～10klx光照度。而在類胡蘿卜素積累階段，光照強度應該在25～30klx的范圍內。另外在高光強度下，杜氏藻會產生較大比例的順式異構體，其中9-順式-β-胡蘿卜素可達50%[10]。據報道[11]，在一定的脅迫條件下(如高強度的光照)，杜氏藻能夠大量積累β-胡蘿卜素，同時又可生產豐富的蛋白質和必需脂肪酸。另據報道，杜氏藻具有多種健康功能，如抗高血壓、擴張支氣管、止痛、松弛肌肉和抗水腫等。

FDA已經認可杜氏藻的藻體可以直接用作食物或飼料[11]。用食用油或者是食品安全級有機溶劑從杜氏藻中提取的β-胡蘿卜素可用在各種食品的配方中，例如用橄欖油和豆油提取的β-胡蘿卜素可用在藥物配方中。需要指出的是，在天然提取物中，通常會含有少量的其他類胡蘿卜素，因此在市場上銷售的產品多為混合物。

澳大利亞、中國、印度、以色列、日本和美國都是杜氏藻的主要生產地。此外，在其他幾個環境條件適宜的國家也有小規模的生產。目前，市場上存在很多不同種類的杜氏藻源β-胡蘿卜素產品。純化過的β-胡蘿卜素大部分以1～20g/100mL的含量分散在植物油中出售，可作為添加劑和著色劑應用。同時，也可制成軟膠囊出售。一般每個膠囊含5mgβ-胡蘿卜素。

1.1.2 三孢布拉霉

三孢布拉霉是一種與熱帶植物共生的霉菌，分正株和負株兩種類型。正株合成三孢子酸，三孢子酸既是β-胡蘿卜素的代謝物，又是其生物合成的調節劑。以特定比例交配兩種類型的菌株，三孢子酸就能夠刺激負株合成大量的β-胡蘿卜素。

生產過程基本上分兩個階段：第一階段：以葡萄糖和玉米漿作為碳源和氮源進行發酵。開始時，進行原始菌株培養，隨后用有氧深層發酵來產生豐富的β-胡蘿卜素；第二階段：也稱恢復階段。在這一階段中，菌株被分離和轉化成適合提取β-胡蘿卜素的形式。被分離的?-胡蘿卜素可在乙酸乙酯中結晶達到適當的純化和濃縮目的。最后的產品是β-胡蘿卜素晶體或者是30g/100mL質量濃度的植物油分散體系[12]。

從三孢布拉氏霉生產β-胡蘿卜素首次嘗試是在1995年。通過在小鼠上進行的動物實驗和對最終產品中4種真菌毒素的酶聯免疫法測定，以小鼠的致病性為檢測標準，已經證實三孢布拉霉沒有致病性和毒性[13]。通過HPLC分析、穩定性檢測和微生物檢驗證實了由三孢布拉霉發酵所得到的β-胡蘿卜素晶體符合歐盟專家委員會在95/45/EC法規中列出的反式和順式異構體的比例，未檢出真菌毒素或其他有毒代謝物和遺傳毒性等。用所產的β-胡蘿卜素產品喂養大鼠28d后，未發現有害的癥狀。據此，歐盟委員會規定以日常飲食的5%為最高攝入劑量。歐盟科學委員會認為由三孢布拉霉發酵所得到的β-胡蘿卜素與由化學合成品在做為食品著色劑時具有相當的作用。因此，可以做為食品著色劑使用[14]。

目前，在俄羅斯、烏克蘭和西班牙均有由三孢布拉霉生產β-胡蘿卜素的工業生產。其產品的含量已經達到30mg/g 平基或3g/L培養液[15]。

1.1.3 布拉克須霉

布拉克須霉(Phycomyces blakesleeanus)也屬于真菌，也是β-胡蘿卜素的一種重要來源[16]。在適宜條件下，野生型菌株中β-胡蘿卜素的含量大約在0.05mg/g干基。有些突變株能夠積累到10mg/g干基[17]。在工業生產中，通常使用發酵桶培養布拉克須霉[18]。

1.1.4 卷枝毛霉菌

野生型卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)由于積累β-胡蘿卜素而顯橙黃色。藍光的誘導是其體內類胡蘿卜素生物合成的必需條件[19]。卷枝毛霉菌既可以單細胞又可以菌絲體的形式生長，是二相性真菌。現在研究的重點是利用生物技術獲得有用的酵母樣突變株[14]。

1.2 番茄紅素

番茄紅素可以通過化學法合成或從番茄中提取。發酵法大規模地生產番茄紅素的技術也已形成。不同的生產方法造成產品中幾何異構體組成的差異見表2[20]。

表2 不同來源番茄紅素的幾何異構體組成Table 2 The geometrical isomer composition of lycopene from different sources%

番茄紅素是β-胡蘿卜素等所有雙環類胡蘿卜素生物合成的前提。因此，可以通過在微生物體內阻止環化反應或抑制環化酶來積累番茄紅素。這種方法已經在商業生產番茄紅素中應用。

1.2.1 三孢布拉霉

目前商業中已經建立了從三孢布拉霉生產番茄紅素的生產工藝。在液體培養液中加入咪唑或嘧啶可抑制番茄紅素環化酶[21]，使體內積累番茄紅素。產品中主要是全反式番茄紅素。可在產品中加入番茄紅素量1%VE。產品的形態一般為20%或5%的葵花油分散體系。番茄紅素油分散液可用作食品配料和食品強化劑。

根據歐洲議會和理事會關于新食品和新型食品添加劑使用的第258/97號法規，批準可在食品中使用由三孢布拉霉生產的番茄紅素[22]。歐洲食品安全局評價本產品可作為食品色素使用。具體結論是：由三孢布拉霉生產的番茄紅素在營養上相當于天然番茄紅素，但還需要進一步的安全性實驗。

1.2.2 擬枝孢鐮刀菌

目前，擬枝孢鐮刀菌(Fusarium sporotrichioides)已被遺傳工程改造成為可以用廉價的玉米纖維(生產酒精的殘渣)為原料來發酵生產番茄紅素[23]。具體的過程為：借鑒于歐文氏細菌(Erwinia amylovora)的改造工作，使用多DNA序列定向克隆技術，將菌的類異戊二烯途徑重新定向為通過類胡蘿卜素生物合成基因合成類胡蘿卜素。在實驗室培養瓶中培養6d的產量是0.5mg番茄紅素/g干基，目前，實驗還在進一步改進中[24]。

1.3 蝦青素

蝦青素添加在水產養殖飼料中用以改善魚及甲殼動

物的體色。據報道稱蝦青素對人類有很重要的保健功能，所以將其作為營養型食品添加劑有很大的意義。雖然化學合成蝦青素仍然是市場的主導，但由微藻、酵母菌和細菌通過生物技術生產蝦青素是現在深入研究的主題[25]。

1.3.1 雨生紅球藻

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)屬綠藻。其體內的蝦青素積累量能夠達到0.2～2g/100g干基[26]。美國食品和藥物管理局(FDA)已允許利用雨生紅球藻生產的蝦青素用于食品，幾個歐洲國家也已經批準將其作為膳食補充劑。

雨生紅球藻屬于淡水藻，在自養和異養條件下都能生長。在戶外環境中很容易受到其他不良物種的污染。其生長溫度在20～28℃范圍內，光照度在15klx，pH值在6.8～7.4之間。此條件下，它很容易受到細菌、真菌和原生動物的污染。所以，戶外培養雨生紅球藻需要盡量減少污染，適當控制光照和溫度等環境條件。在培養過程中如改變物理條件和細胞的營養，可影響雨生紅球藻的生長和其體內類胡蘿卜素的積累。高光照強度會顯著地影響其細胞的生長。可行的藻蝦青素商業生產技術需要一個有效的封閉式培養系統和篩選比野生菌株耐高溫的高產藻株。目前在印度、日本和美國都有成功的商業生產。近年來，人們又研究出用帶有人工光照的封閉生物反應器與戶外池塘聯用的生產技術來培養雨生紅球藻[27]。

與杜氏藻不同，雨生紅球藻在生長過程中游動的鞭毛細胞變為不運動的厚壁孢子。在這些不動的孢子內會積累蝦青素[28]。不動孢子內蝦青素含量一般在1～2g/100g干基范圍內。但在提取蝦青素之前需要對其厚壁進行物理破碎[29]。

1.3.2 紅法夫酵母

在能夠生產蝦青素的微生物中，紅法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)很適合商業生產蝦青素[30]，但產品是(3R，3 R)異構體(圖1b)。不同營養物質(如蛋白胨、麥芽和酵母提取液等)對紅法夫酵母生長的影響已經有過許多報道。同時，使用許多農副產品(如糖蜜、木材水解產物、玉米漿、甘蔗渣、甘蔗汁、葡萄汁等)作為營養物質的嘗試也有不少。蝦青素產量最高的培養條件是：溫度19.7℃、碳源11.25g/L、pH6.0、接種量為體積分數5%。在這種條件下，蝦青素的含量可達到8.1mg/L[31]。通過補料分批培養(在有限的培養基中補加培養液)的方法發現發酵方法也會影響紅法夫酵母的生長和類胡蘿卜素的積累。恒定pH值培養(為調整pH值而加入營養物質)條件下最高的菌株含量在17.4g/L[32]。同時，突變株的傳代與優化也已經開始研究[33]。在理論層面，蝦青素生物合成的途徑和過程也在引起人們的關注。

在作為動物飼料時，為了提高動物腸道對蝦青素的吸收率，也必須破壞發酵菌株的細胞壁。已有化學、物理、自溶和酶法破壞細胞壁的方法。關于蝦青素產量的改善技術每年都有新的專利申請。目前最高的含量已經達到了3mg/g干基[34]。

1.3.3 橙黃農桿菌

蝦青素是存在于橙黃農桿菌(A g r o b a c t e r i u m aurantiacum)中10種類胡蘿卜素的一種。蝦青素在其體內的生物合成途徑已經被研究過[35]。影響其體內類胡羅卜素積累的生長條件和蝦青素葡萄糖甙的產生過程已有報道，但是還沒在商業應用上應用。

為了尋找新的蝦青素細菌來源，人們已經進行了許多篩選工作，分離出了一些可能的目標菌株。如球菌和嗜鹽桿菌[36-37]。后者尤為具有優勢，因為：1)培養液中高質量濃度的氯化鈉(20g/100mL)會防止其他雜菌的污染，所以不需要嚴格的滅菌措施；2)氯化鈉在15g/100mL的質量濃度時就能夠誘導細菌解體。因此，不需要特殊的細胞破碎技術，就可以對色素進行提取。提取溶媒可以直接用葵花油而不用有機溶劑。這樣就消除了產品中的溶劑殘留，而且加速了動物對色素的吸收。然而，這種技術還沒發展為商業技術。

1.4 玉米黃質

玉米黃質能夠增強鳥綱動物(如家禽)外表的黃色或者是其蛋黃的顏色[38]，可以作為著色劑應用在化妝品和食品中。同時，它還具有維持眼健康的功能。

在20世紀60年代，人們已分離出了幾種能夠產生玉米黃質的海生細菌。在葡萄糖或蔗糖作為碳源的培養液中培養黃桿菌(Flavobacterium sp.)能夠達到生產190mg玉米黃質/L培養液的水平[39-41]，合16mg/g細胞干質量。目前很多人在研究原黃桿菌(Sphingobacterium multivorum)[42]。這一菌種用在商業產業中可大量生產玉米黃質。另一種生產玉米黃質的菌是黃質菌(Zeaxanthinifaciens)。最近，它被重新分類為副球菌種[43]。

1.5 角黃質

多年來，角黃質已被用于水產飼料中形成和增添鮭魚、鱒魚所需的肉色。人體過量的攝入角黃素可導致在人眼中有微小的晶體沉積。所以，角黃素作為一種食品補充劑還不能被人們接受，在水產飼料上也受到一定的限制。

一些細菌有希望用于角黃素的商業生產。有一種能夠生產角黃素的慢生菌(Bradyrhizobium sp.)[44]，其合成類胡蘿卜素的基因組已經被全部測出。另一種微生物是極端嗜鹽古菌(Haloferax alexandrinus)。由于嗜鹽古菌積累C50-類胡蘿卜素，所以大部分菌體都是紅色的。據報道，有些種能夠合成C40-胡蘿卜素以及一些酮基類胡

蘿卜素。由于這些嗜鹽古菌獨特的功能在生物技術上有很大的應用潛力，進而給工業生產帶來了極大便利。例如，培養基中極高的氯化鈉濃度(15%～30%)，可以阻止其他微生物的污染，所以培養時可以不需要高壓滅菌[45]。另外，因為細胞在淡水中能夠發生自溶[46]，不需要細胞破碎設備。用1L的搖瓶培養，在開放的培養條件下，可生產3g干質量的物質，其中含總類胡蘿卜素有6mg和2mg的角黃素[47]。

第3種細菌是戈登氏菌(Gordonia jacobea)，為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌[48]。通常在常規空氣采樣過程中分離出體內以角黃素為主色素的粉紅色菌落[49]。初次得到的野生菌落中類胡蘿卜素的含量較低。但是，經過幾輪的突變篩選后，可得到角黃素含量比野生菌株多6倍的突變體。通過優化培養基，可實現角黃素的含量在1～13.4mg/L之間[49]。這個突變種，從工業觀點上看存在著一些潛在的優勢：1)最佳的生長溫度和類胡蘿卜素積累溫度是30℃，這是發酵罐中最易實現的溫度條件；2)廉價的葡萄糖是菌體生長和色素積累的最佳碳源；3)乙醇能夠直接萃取總色素的90%以上，所以，萃取物很安全[50]。

2 從轉基因微生物中生產類胡蘿卜素的前景

所謂代謝工程是指在活細胞內，利用重組DNA技術來修改細胞的代謝系統，使活細胞能夠合成(代謝)出所需要的化學物質，并獲得高產量。最理想的載體是能夠自然合成所需化學物質的微生物。但能夠自身合成所需化學物質前體的微生物也是很有價值的[51]。

人們已經從不同的微生物中分離出大量基因，它們能夠編碼類胡蘿卜素生物合成所需的酶和調控類胡蘿卜素的生物合成。這些基因的功能也已經被鑒定出。

一些細菌(如大腸桿菌)不能自身合成類胡蘿卜素，但引入類胡蘿卜素合成基因后就能夠發生類胡蘿卜素生物合成過程。大腸桿菌本身能夠合成異戊二烯化合物(如長鏈醇和醌)。因此，將類胡蘿卜素合成基因引入后，原有合成代謝物為類胡蘿卜素的生物合成提供可行的直接碳通量。目前，由質粒攜帶的能夠合成番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質的類胡蘿卜素合成基因，已經在大腸桿菌中重組和表達出。轉基因細菌中積累的番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃質已經可以達到0.2～1.3mg/g干基的產量；實際上，除了少數如玉米黃質C(5,6)環氧化酶基因外，幾乎所有的類胡蘿卜素生物合成基因克隆均能夠在大腸桿菌中表達[52]。

為了進一步增加類胡羅卜素合成量，對于生物技術最重要的挑戰是合成過程的調控[53]。據報道，合理控制丙酮酸和甘油三磷酸的比例，番茄紅素的產量可達到25mg/g干基[54]。類胡蘿卜合成素基因所編碼的酶活性應當存在著一個平衡調節系統。這個系統的表現應該是：在一個類胡蘿卜素合成系統中，當沒有中間合成代謝物池(貯存庫)時，如果合成的終端產物數量減少，合成前體物的轉化效率應當增加。即：這應當是一個“負反饋調節”系統。換言之，目標基因重組質粒的重要作用之一應當是減少中間物的積累，提高最終產物的產量。最后，宿主生物體應表現出極活躍的萜類合成途徑和具有較高的類胡蘿卜素終端產物的存儲能力。

除了大腸桿菌，食用酵母、朊假絲酵母和釀酒酵母在引入類胡羅卜素基因后也具有合成類胡蘿卜素的能力[55]。

現在很多分子生物學技術在這個領域中是可行的，但還有許多問題有待解決，尤其是在涉及到控制最終產品上。在許多情況下，人們的目的是獲得單一的目標產物和積累高濃度的類胡蘿卜素，而不是一個復雜的混合物。這使工作的難度增加很多。

3 前 景

在無盡的大自然中有非常多的微生物可以合成類胡蘿卜素。在市場上消費者的接受程度、法規監管部門的批準以及把產品推向市場所需的投資影響著發酵生產的類胡蘿卜素產品的最終成功。在過去很長的一段時期內，因為昂貴的發酵設施、監管機構的嚴格要求以及長期的毒理研究，人們對發酵法生產類胡蘿卜素提出了許多質疑。然而，現在的情況已經有所好轉。目前市場上已經有一些由發酵生產的類胡蘿卜素產品在銷售，這反映了消費者的認可程度。有理由相信，發酵法的產品在未來的市場會有一個良好的前景。

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Research Progress of Carotenoids of Microbial Origin

ZHAO Ting，LIN Kong-liang，HUI Bo-di*
(College of Applied Arts & Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

The importance of carotenoids to human health is increasingly attracting people s attention. More and more carotenoid based functional foods are coming to markets. It is a tendency to progressively replace synthetic compounds and phytochemicals by low-cost, high-purity and safe products of microbial origin to meet the ever-increasing consumer demand for carotenoids. This article reviews the distribution, sources, production techniques and market potential of carotenoids of microbial origin in an effort to provide

for more effective utilization of this resource and the research and development of production techniques for safer and premium carotenoids based products.

carotenoid；microorganism；microalgae；trans-gene

TS201.24

A

1002-6630(2010)23-0461-06

2010-09-17

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAI58B06)

趙婷(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質制備及生理功能。E-mail：zhaoting72886@163.com

*通信作者：惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向為類胡蘿卜素生物化學。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn