無償獻血人群HCV感染的檢測和輸血殘余風險分析

歐陽玲，黃建國，謝秀華，黃守民

(廣東省深圳市寶安區中心血站，廣東 深圳 518101)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)引起的在全世界流行的傳染病。椐WHO報道，全球約有1.7億感染者(流行率約3%)，我國感染者約為4100萬。HCV傳播主要是通過污染的血液和血制品，傳播途徑主要有輸血、靜脈注射毒品、性傳播、不潔醫療儀器應用、紋身和母嬰傳播等[1]。我國國家標準規定采供血機構對獻血者血液必須采用EIA法進行抗-HCV抗體的檢測，通過檢測抗-HCV可大大降低輸血后感染HCV的風險，但是由于檢測抗-HCV的窗口期較長，目前仍存在一定潛在的輸血后傳播HCV的風險。為了進一步減少輸血傳播的HCV的風險，保證臨床輸血安全，為了解本地區獻血者人群HCV感染情況，以及經病毒血清學篩查后的輸血感染HCV殘余風險，我們引進羅氏診斷公司NAT檢測試劑COBASAmpliScreens對血液進行HCV RNA檢測[2]，現將研究結果報告如下。

材料與方法

1檢測對象和標本采集

1997年1 月至2009年6月在深圳市寶安區中心血站獻血的所有志愿無償獻血者，采集血液樣本共254570人份，其中男性151 760人，女性102 810人，年齡范圍18～55歲，平均26歲。NAT檢測用樣本采用無菌抗凝管(美國BD公司)留取全血5m l，于6h之內離心分離出血漿，并凍存在-20℃冰箱。

2主要試劑和儀器

抗-HCV檢測EIA試劑分別來自廈門新創、華美生物、美國雅培和Ortho公司，試劑盒均有中國生物制品研究所批批檢及防偽標簽。HCV RNA NAT檢測試劑COBASAmpliscreen HCV Test Ver 2.0試劑盒和病毒核酸的提取試劑Multiprep Specimen Preparation Reagents Kits為瑞士羅氏診斷公司產品。

3無償獻血者血液的病毒血清學檢測

所有獻血者血液標本按照國家《獻血者健康檢查要求》(GB 184672 2001)進行常規的抗-HIV-1/2、抗-HCV、HBsAg、抗-TP和ALT項目的初檢和復檢。其中抗-HCV EIA篩查試劑初檢為國產試劑廈門新創或華美生物,復檢為進口美國雅培或Ortho公司試劑,采用美國奧斯邦AT全自動樣本加樣系統加樣和費米全自動酶免分析系統進行自動檢測，任何一種試劑檢測呈陽性反應報告為抗-HCV陽性。

4無償獻血者血漿標本中HCV RNA的NAT檢測

采用混合樣本NAT(MP-NAT)方法檢測EIA-陰性的獻血者血液標本[4]。將EIA檢測HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2陰性和ALT正常的血漿標本，按48份×50μl匯集于 2個離心管中 (1份備用)，23 600g，4℃離心 1h，吸去上清，留 200μl血漿，用 Multiprep Specimen Preparation Reagents Kits提取病毒核酸，具體按說明書操作。用COBASAmpliScreens HCV Test(Ver 2.0)試劑檢測HCV RNA,由配套Ampilcor分析儀自動完成RT-PCR擴增、變性、探針雜交、顯色、檢測和結果判斷。MP-NAT檢測呈陽性反應時，將其2個24份混合標本分別檢測，24份混合標本檢測呈陽性反應時，將這24份標本按6×4排列交叉混合匯集成10組再進行檢測，根據交叉組合判斷具體的陽性反應標本，最后再對陽性反應標本進行單人份NAT(ID-NAT)檢測。EIA檢測抗-HCV呈不確定反應的血液標本進行單人份NAT檢測。

5 HCV的定量檢測和基因亞型測定

[3]合成引物，用逆轉錄-套式聚合酶鏈反應(RT PC)擴增HCVE1和 NS5B基因，擴增陽性的PCR產物用雙脫氧鏈終止法進行雙向核苷酸序列測定，對所測定的基因進行基因分型。同時采用TagMan熒光定量PCR檢測HCV RNA水平。

結 果

1 EIA檢測獻血者中抗-HCV的結果

用EIA法共篩查1997年1月～2009年7月所有的無償獻血者，每年篩查出抗-HCV陽性0.36～1.20%之間。13年來共篩查254 570人份的獻血者血液標本，篩查出抗-HCV呈現陽性反應1 401人份，總的陽性率為0.55%(表1)；在不同性別的獻血者中的抗-HCV檢測結果見表2。

表1 深圳無償獻血人群中HCV感染者EIA和NAT檢測結果

表2 不同性別獻血者中抗-HCV陽性檢出率

2合格獻血者中HCV RNA的檢測結果

對 2002～2007年期間 EIA檢測 “合格”的113639份獻血者血液標本進行NAT檢測，結果檢測出1份HCV RNA陽性、抗-HCV陰性的獻血者血液，HCV殘余風險高達1/113 639。該例獻血者的標本的檢測結果見表3。此外，對EIA檢測抗-HCV不確定的163份獻血者標本進行單人份NAT(IDNAT)檢測,未檢測出1例HCV RNA呈陽性反應的標本。

3 HCV RNA陽性獻血者病毒載量和基因分型檢測

表3 EIA抗-HCV陰性、NATHCV RNA陽性獻血者標本的檢測情況

從抗-HCV陰性的獻血者中分離出的HCV分離株，序列分析為1b基因型。病毒定量為2.6e+5 copies/ml(表 3)。

討 論

在1998年《中華人民共和國獻血法》頒布實施前，我國職業獻血者和HCV感染率一直處于一個較高的水平，文獻報道為3.2～56.7%，輸血傳播肝炎主要以HCV感染為主[4]。《獻血法》實施后,我國逐步實施無償獻血制度，臨床血液采自公民的無償自愿獻血。無償獻血者中HCV感染率明顯低于既往的職業獻血者，從1997～2000年間的4.6%下降至2004～2007年的0.335%[5]。從我站的數據看，在2001年之前，抗-HCV陽性率位于0.63～1.2%之間，2002年～2009年抗-HCV陽性率位于0.34～0.58%之間，呈現下降趨勢。無償獻血者中抗-HCV陽性率的下降，使輸血的安全性得到了提高。

雖然應用第三代EIA試劑對獻血者進行抗-HCV的篩查后，輸血傳播HCV得到明顯的控制，但輸血感染HCV的風險仍然存在。文獻報道我國目前輸血傳播HCV的風險約為1/60000～1/40000[6]。研究顯示使用3代EIA試劑盒進行血液HCV篩查后的窗口期為70～83d，而核酸擴增技術(NAT)由于直接檢測病毒核酸,可使HCV檢測的窗口期縮短至22d，能夠降低輸血傳播HCV的殘余危險度50%以上。目前,已有20多個國家和地區將NAT檢測作為獻血者的常規血液篩查項目。在歐美等一些HCV感染率較低的國家,NAT檢出率在1/23.4～1/205萬之間[7]；在HCV感染較高的一些東南亞國家,NAT檢出率在 1/5.2～1/14.3 萬之間[8]。本地區 2001～2004年的無償獻血者資料回顧總結，經數學模型分析推測的HCV殘余風險為1/59588[6]，本研究在113639份血清學檢測合格的獻血者標本中發現1份HCV窗口期感染的血液，檢出率為1/113639，與東南亞國家的檢測情況相接近。本地區輸血傳播HCV風險比較高，控制輸血傳播HCV任重道遠。NAT檢測由于成本等因素尚未列入國家對血液的強制檢測項目，但考慮本地區獻血者的特點和HCV流行情況，增加MP-NAT篩查血液對減少輸血傳播病毒感染的風險意義重大。

參考文獻

[1]Verbeeck J,Maes P,Lemey P,et al.Investigating the origin and spread of hepatitis C virus genotype 5a[J].JVirol,2006,80(9):4220-4226.

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[3]Lu L,Nakano T,He Y,et al.Hepatitis C virus genotype distribution in China:predominance of closely related subtype 1b isolates and existence of new genotype 6 variants[J].Journal of Medical Virology,2005,75(4):538-549.

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[8]Wong L,Lam S,Teo D.Overview of nucleic acid testing(NAT)on blood donations in Singapore[J].Vox Sang,2005,89(Suppl 2):19.