西甜瓜組織培養與遺傳轉化影響因子研究進展

孔維萍，程鴻，蘇永全，劉東順

（甘肅省農業科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州，730070）

建立高效的離體培養再生體系是植物遺傳轉化成功的基礎。目前已能夠通過器官發生途徑獲得西甜瓜再生植株，有的還建立了比較高頻的再生體系[1～4]。西甜瓜生產中主要的問題是病蟲害嚴重以及品質、產量不高等。目前利用遺傳工程方法改良甜瓜種質的研究主要有轉化病毒的外殼蛋白基因、耐鹽基因和ACC氧化酶反義基因等，并獲得了轉基因植株[5～7]。本文對西甜瓜再生體系建立與農桿菌介導遺傳轉化的影響因素作了綜述，為進一步開展轉基因研究、創造新的種質資源，特別是抗性種質資源，提高育種水平奠定良好基礎。

1 再生體系建立的影響因素

1.1 基因型

材料的基因型對愈傷組織的器官分化有決定性的影響。外植體的基因型是影響離體培養再生的內在因素。不同品種西甜瓜的組培情況差異極大，植株再生頻率隨基因型的不同而不同[8]，薄皮甜瓜的子葉組織培養再生能力比厚皮甜瓜容易得多。潘俊松等[9]對8個品種甜瓜子葉節離體培養的結果表明，基因型對子葉節叢生芽的誘導有較大影響，其中再生不定芽數最高的為12.5個，最低為7.2個。Galperin等[10]選用了30份材料研究，表明甜瓜器官的再生能力因基因型的不同而不同。孫治圖等[11]以23種基因型材料的西瓜無菌苗子葉為試材，運用方差分析篩選高效基因型材料及芽誘導最適培養基。結果表明，基因型不同的材料誘導效果有明顯差異，最高誘導率達到90.0%，篩選的芽誘導最適培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L。

1.2 取材部位及時間

甜瓜組織培養研究中，目前大多數報道[12]指出不同基因型品種的幼嫩子葉都可得到較高頻率的再生不定芽，而真葉、下胚軸、莖尖等部位再生頻率很低。馮鳳娟等[1]以新梢頂端展開的第2~3片葉在MS+6-BA 1.0 mg/L的誘導培養基上，外植體遠軸面向下接觸培養基，直接轉入正常光周期下培養再生頻率可達100%，平均每個外植體上可誘導出11株健壯植株。王果萍[13]以西瓜未成熟胚及子葉、幼苗莖尖、子葉及下胚軸切段進行離體再生培養結果表明，子葉誘導再生效果最佳。李娟等[14]以7種不同基因型西瓜為試材進行離體花藥培養，對誘導愈傷組織的條件進行了研究，結果表明，西瓜離體花藥誘導率達到了68.42%，為西甜瓜組織培養提供了新途徑。

同一外植體不同部位不定芽誘導率與誘導方式有差異。馬國斌等[15]的研究表明，西瓜和甜瓜組織培養中，子葉和真葉外植體切塊形態學下端部位總是首先大量發生愈傷組織或分化出器官，而切塊形態學上端則很少或幾乎不發生愈傷組織或器官。王春霞等[16]對京欣1號西瓜子葉進行芽分化試驗的結果表明，子葉的不同部位再分化能力并不相同。另外外植體切割以及培養方式對誘導出苗也有很大影響。潘俊松等[9]的研究表明，先切頂芽的后期成苗時出現畸形苗，切割1/3子葉的誘導率不如后切頂芽的，子葉老化快，產生黃化和萎縮等現象。孫天國的研究結果表明，橫、縱切子葉外植體的愈傷組織生長速度、著生位置、芽原基的分布和生長速度均不同，出芽率差異也很大。認為縱切破壞了子葉表面最大的維管束，使植物體內內源激素的量減半，內外源激素的聯合作用減弱，而使得誘導能力降低，抑制了芽的誘導與分化。培養方式也同樣會影響甜瓜葉片的再生，馮鳳娟等[1]的試驗表明遠軸面接觸培養基是甜瓜葉片再生適宜的放置方式，分析其原因可能是因為葉背面氣孔較多，角質層不發達，有利于營養的吸收。

1.3 培養基以及生長調節物質的種類和濃度

不同外植體選用相同的基本培養基，或同一外植體選用不同的基本培養基的不定芽誘導率均不同。于喜艷等[17]研究表明，改良的Miller培養基獲得的不定芽誘導率較高。馬國斌等[15]報道，改良的MS培養基也可得到較好的不定芽分化效果。鄧向東等[18]的研究表明，LS培養基對哈密瓜的不定芽誘導效果較好，有提高不定芽生活力、增加不定芽數量的作用。這可能是由于甜瓜本身的內源生長素的含量比較高，而不需要人為添加，如果添加，就會引起愈傷組織的發生，不利于不定芽的誘導。可見，不同培養基均可誘導出不定芽，但不同品種甜瓜的適合培養基不同。

植物組織不同對植物激素的要求有很大變化，這取決于它本身的內生激素水平。馮鳳娟等[1]的試驗結果表明，甜瓜不定芽誘導中，生長素是非必要的，適宜甜瓜葉片誘導的培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L，不需要IAA。在甜瓜組織培養中，常用的細胞分裂素的類似物是6-BA和KT，生長素的類似物中常用的是IAA、NAA和IBA。添加不同的植物生長調節物質或組合的組培效應不相同。 鄧向東等[18]在以 6-BA、ZT、KT、2iP和2，4-D誘導哈密瓜不定芽的試驗中觀察到，6-BA的誘導效果最好，其最適濃度為0.5 mg/L，而高濃度的ABA（2.0 mg/L）可以提高網紋哈密瓜的誘導率。此外，ABA對子葉誘導不定芽也有一定的作用。于喜艷等[17]用6-BA和IAA組合誘導的結果表明，低濃度的IAA（0.2 mg/L）有利于厚皮甜瓜子葉的分化，而對薄皮甜瓜幾乎沒有影響。李娟等[14]、曹華興等[19]的研究結果也表明，培養基中激素的種類、用量和配比，對誘發小孢子啟動、分裂、生長和分化起決定性作用。

此外如AgNO3、VC、脯氨酸、水解酪蛋白以及活性碳等添加物通過調節代謝過程對愈傷組織誘導及分化也有一定影響。

2 農桿菌介導遺傳轉化影響因素

遺傳轉化方法有農桿菌介導法、基因槍法、電擊法、花粉管通道法等，目前西甜瓜遺傳轉化多采用農桿菌介導法。

2.1 菌株

目前，西甜瓜遺傳轉化中常用的菌株為章魚堿型的LBA4404與農桿堿型的EHA105。Fang等[20]是最早報道用根癌農桿菌改良株系LBA4404，并成功地將NPTⅡ基因（抗卡那霉素基因）轉入甜瓜品種。王慧中等[21]以含選擇標記基因NPTⅡ和WMV-1CP（西瓜花葉病毒）基因雙元載體pBEWMV的根癌農桿菌LBA4404感染甜瓜子葉外植體，獲得可育的轉基因甜瓜植株。顏雪等[7]也是采用農桿菌LBA4404對新疆感病甜瓜進行轉化，獲得抗枯萎病甜瓜新品種。張志忠等[22]分別用農桿菌菌株LBA4404、AGL-1和EHA105侵染同一西瓜品種，結果表明，EHA105的侵染能力明顯優于LBA4404和AGL-1。李建勇等[23]用農桿菌LBA4404（含pCAMBIA1301重組質粒）轉化浙密2號西瓜，經GUS檢測獲得抗性芽。

2.2 菌液濃度及侵染時間

農桿菌菌液濃度是影響轉化效率的關鍵因素之一。濃度過低，農桿菌數目不足而影響侵染效率，濃度過高，農桿菌過度繁殖又會對外植體造成傷害，從而降低轉化效率。另外適宜的侵染時間可以使較多的農桿菌附著于外植體傷口處；但時間過長，外植體在后期培養中易發生褐化死亡。李建勇等[23]將菌液濃度稀釋到 OD600分別為 0，0.1，0.3，0.5，0.7， 侵染時間設為0，5，10，15 min，結果表明 OD 為 0.3，侵染時間 10 min效果最佳，侵染效率達67.7%。

2.3 預培養和共培養時間

預培養可以淘汰生命力弱的外植體，促使外植體盡早適應組織培養環境而進入萌動狀態，在一定程度上提高轉化率。但預培養時間過長則會使外植體切面表皮細胞形成潛伏芽，使轉化率降低，假陽性率增高。共培養時間過短轉化率極低，但共培養時間過長，農桿菌會過度繁殖，從而造成植物細胞因受到毒害而死亡，降低轉化率。顏雪等[7]通過根癌農桿菌介導法將外源基因成功導入甜瓜中，采用的預培養和共培養時間均為3 d。李建勇等[23]的結論指出，預培養2 d，共培養時間為3 d時轉化率最高，達到63.3%。

2.4 抗生素

在用根癌農桿菌轉化植物細胞時，常用頭孢霉素和羧芐青霉素控制根癌農桿菌的過量生長，而且兩者除了抑制根癌農桿菌的生長外，還影響植物的生長發育。過量頭孢霉素易引起傷口細胞褐化、死亡，抑制芽的分化；而羧芐青霉素則促進芽分化，抑制生根。李建勇等[23]指出，潮霉素對西瓜的分化有很強的抑制作用，隨著潮霉素濃度的上升，外植體存活率顯著下降，當潮霉素在15 mg/L或以上濃度時，可以完全抑制芽的分化，因此可以作為轉化細胞篩選濃度。300 mg/L的頭孢霉素抑菌效果相對較好，對芽分化的影響最小。張智俊等[24]的結論表明，75 mg/L的Kan可以作為篩選轉化體和非轉化體的臨界濃度，而Amp的抑菌濃度為200~400 mg/L。

2.5 其他添加物

李建勇等[23]在共培養培養基中加入20 mg/L的乙酰丁香酮（AS）顯著提高了西瓜子葉外植體的轉化效率，轉化率高達70%，遠遠高于沒有加AS對照的轉化率（20%）；張志忠等[22]在共培養培養基中添加AS可明顯提高轉化效率，最高達74.8%，而在其他條件類似情況下不經此處理的轉化率僅為46.6%。由此可見，轉化過程中使用AS對提高轉化率是有益的。

目前關于AgNO3在組織培養和轉化中的作用機理有3種解釋，一些研究認為，AgNO3是乙烯作用的抑制劑，它能通過促進多胺的合成提高體細胞胚胎和芽發生的頻率。Chi等認為AgNO3并不是抑制乙烯的合成，而是促進ACC合成酶活力和ACC的積累。另外還有研究認為Ag+在促進植株再生上與多胺代謝無關，Ag+抑制乙烯活性可能是通過競爭性結合細胞上的乙烯受體蛋白，起到阻止或降低乙烯的作用。

3 結語

植物病蟲害生理小種變異比較迅速，很難用化學和物理方法防治，我們可以從廣譜、持久的抗病基因方面入手，探索更有效的防治途徑。另外我們可以嘗試利用胚乳培養來產生三倍體，從根本上改進利用二倍體和四倍體雜交產生三倍體的育種手段。

目前大多數轉基因工作仍停留在試驗研究階段，在生產中的應用還較少。另外轉基因植物潛在的毒性和環境安全性是植物抗真菌基因工程推向市場的最大障礙。我們應該建立可靠的轉基因植物毒性和環境安全風險性評價系統，對植物特別是作物抗病分子機理進行深入研究、完善轉基因技術體系，使基因工程在作物種質創新、作物育種上得到更廣泛的有效應用。

[1]馮鳳娟，梁東，馬鋒旺，等.甜瓜葉片高效再生體系的建立[J].西北農業學報，2008，17（5）：321-324.

[2]褚劍峰，鄭琪，林國美.西瓜和甜瓜的組織培養技術研究[J].安徽農業科學，2004，32（6）：1 169-1 170.

[3]Adelberg J W,Rhodes B B,Skorupska H T.Generating tetraploid watermelon and melon from tissue culture[J].Hort Science,1990,25(9):73.

[4]Galperin M,Patlis L,Ovadi A,et al.A melon genotype with superior competence for regeneration and transformation[J].International Journal of Dairy Technology,2003,122(1):66-69.

[5]Dong J Z,Yang M Z,Jia S R,et al.Transformation of melon(CucumismeloL.)and expression from the cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic melon plants[J].Biotechnology,1991(9):858-862.

[6]黃永紅，陶興林，陸璐，等.甜瓜ACC氧化酶反義基因植物表達載體的構建及轉化煙草的研究[J].西北植物學報，2005，25（2）：262-268.

[7]顏雪，趙惠新，王賢磊，等.甜瓜抗枯萎病基因表達載體的構建及其轉化[J].生物技術，2008，18（3）：9-11.

[8]陶興林，黃永紅，趙長增，等.厚皮甜瓜品種離體培養再生植株能力的基因型差異研究[J].果樹學報，2005，22（3）：252-255.

[9]潘俊松，蔡潤，劉曉，等.甜瓜子葉節培養高效再生體系建立[J].上海交通大學學報：農業科學版，2003，21（4）：295-298.

[10]Galperin M,Zelcer A,Kenigsbuch D.High competence for adventitious regeneration in the BU-21/3 melon genotypeis controlled by a single dominant locus[J].Hort Science,2003(6):1 167-1 168.

[11]孫治圖，許勇，張海英，等.西瓜離體再生高效基因型材料的篩選[J].中國瓜菜，2008（3）：5-9.

[12]白婧，屈淑平，崔崇士.瓜類蔬菜組織培養與遺傳轉化研究進展[J].中國瓜菜，2008（4）：33-37.

[13]王果萍.西瓜高效組織培養技術體系研究[J].中國西瓜甜瓜，2002（2）：1-3.

[14]李娟，張麗，李煥秀，等.西瓜花藥培養技術研究[J].中國瓜菜，2008（4）：8-10.

[15]馬國斌，王鳴.西瓜和甜瓜組織培養中外植體的極性現象和敏感部位[J].果樹科學，1999，16（3）：232-234.

[16]王春霞，簡志英.“京欣1號”西瓜子葉組織培養的研究[J].園藝學報，1996，23（4）：401-403.

[17]于喜艷，何啟偉.甜瓜子葉組織培養的研究[J].山東農業科學，2002（2）：22-23.

[18]鄧向東，耿玉軒.外植體和培養因子對哈密瓜不定芽誘導的影響[J].園藝學報，1996，23（1）：57-61.

[19]曹華興，顧永強，何小華.激素在西瓜組織培養中對不定芽發生的影響[J].上海農學院學報，1986，4（4）：280-283.

[20]Fang G,Grumet R.Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and regeneration of muskmelon plants[J].Plant Cell Rep，1990,9(3):160-164.

[21]王慧中，李亞南，趙培潔.根癌農桿菌介導的甜瓜基因轉化及其轉基因植株的再生[J].浙江大學學報：農業與生命科學版，2000，26（3）：287-290.

[22]張志忠，吳菁華，呂柳新.西瓜高頻再生系統研究[J].中國農學通報，2004，20（2）：151-153.

[23]李建勇，丁淑麗，孫利祥，等.影響西瓜農桿菌介導的高效遺傳轉化效率的主要因子[J].浙江農業學報，2007，19（3）：197-201.

[24]張智俊，羅叔萍.抗生素對甜瓜植株再生的影響[J].中國西瓜甜瓜，2002（1）：6-7.

[25]王光林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學出版社，2002.