轉錄后基因沉默與植物抗病毒研究進展

朱春暉，張德詠，劉勇

（1.中南大學隆平分院，湖南長沙，410125；2.湖南省植物保護研究所）

轉錄后基因沉默與植物抗病毒研究進展

朱春暉1，張德詠2，劉勇2

（1.中南大學隆平分院，湖南長沙，410125；2.湖南省植物保護研究所）

主要綜述了轉錄后基因沉默（PTGS）的發現、定義、機制、與植物抗病毒的關系及利用轉錄后基因沉默防治植物病毒病研究進展。

轉錄后基因沉默；dsRNA；抗病毒

病毒病是農作物的主要病害之一，素有植物“癌癥”之稱，難以防治，給農業生產造成了嚴重損失。據不完全統計，全世界每年因植物病毒病所造成的產量損失約占糧食總產量的10%[1]。許多重要病毒已遍及我國農作物的主要產區，對許多作物造成了不同程度的為害，嚴重影響著這些作物的產量和品質。

目前生產上病毒病防治常用的方法有農具、土壤消毒，使用農藥驅除或殺死昆蟲介體，組織脫毒法獲得無病毒繁殖材料及用傳統育種方法引入抗性基因等[2]。這些方法都有不同程度的弊端，例如噴施農藥不僅價格高，而且造成嚴重的環境污染；組織脫毒法成本高、工作量大、有效期短；抗病育種存在資源貧乏，抗病基因和劣質性狀基因連鎖、周期長、抗性基因遺傳不穩定以及不能解決某些品種間的遠緣雜交等困難。從20世紀80年代初植物基因工程問世以來，科學家們就一直探索用基因工程的辦法來改良作物的抗病毒特性。將病毒基因組上基因的cDNA轉化到其他植物獲取抗病毒植株是當前防治病毒病的重要途徑[3]。即應用來源于病原的抗性 （pathogen-derived resistance），現在已經有轉病毒的CP、MP等基因成功的例子[4]。但使用這種方法獲得高抗轉基因植物的幾率較小，因而尋找一種更高效、經濟的獲取抗病毒轉基因植株的方法已是當務之急，而植物RNA沉默機制的揭示為我們提供了新的防治植物病毒病害的前景[3]。

1 轉錄后基因沉默 （post-transcriptional gene silencing，PTGS）的發現及定義

基因沉默（Gene silencing）[5]是指生物體中特定的基因由于種種原因不表達，主要發生在兩種水平上，一種是由于DNA甲基化、異染色質化以及位置效應等引起的轉錄水平上的基因沉默 （transcriptional gene silencing，TGS），另一種是轉錄后基因沉默（PTGS）。PTGS是指轉基因在細胞核里能穩定轉錄，細胞質里卻無相應的穩定的mRNA存在的現象，即在基因轉錄后的水平上通過對靶標RNA進行特異性降解而使基因失活。基因沉默首先在轉苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）基因的矮牽牛（Petunia）中發現[6]，后來在其他生物中都有關于基因沉默的報道。不同領域的研究者給它作了不同的命名：植物學家稱之為共抑制（co-suppression）或轉錄后基因沉默（PTGS）[7～8]；線蟲和果蠅的研究者稱之為RNA干擾（RNAi）[9]；真菌研究者稱之為消除作用（quelling）[10～11]。這些現象其實都是由同源的轉基因、RNA病毒和雙鏈RNA等誘導產生的一種特定序列的RNA降解機制。進一步的研究發現雙鏈RNA（dsRNA）能夠高效地誘導該機制的起始[12]，隨后它被一種核酶（RNaseⅢ）切割成21~25 nt的小的干擾RNA（siRNA）[13],其中21~23 nt的siRNA與RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）結合，共同作為引導物去選擇目標RNA并對它進行降解。植物中RNA沉默的最顯著特征是它是一種非細胞自發的過程，能夠局部誘導，隨后通過一種可移動的信號分子擴散至整個植物組織[9,14]。其作用表現在抵御病毒、轉座子等外來核酸的入侵、識別并抑制外源基因的表達，具有維持生物基因組穩定性的重要功能[15]。

病毒誘導基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是由植物病毒載體感染植物引起的并啟動相應的寄主中RNA沉默的現象[16]。病毒誘導基因沉默能有效地抑制與內源基因相關的一些生物合成途徑。病毒誘導基因沉默不僅是研究基因沉默機制的熱點，而且還是研究植物抗病防御和植物基因功能的一種有效手段。病毒誘導基因沉默是由RNA介導植物抗病防衛機制（RNA-Mediated Defense，RMD）和一個相關的轉錄后基因沉默機制（PTGS）引起的。已經證明，病毒誘導基因沉默是植物抗病的可能機制[17]。

2 PTGS的機制

PTGS是一個很復雜的過程，目前其機制還沒有統一[18]。從PTGS應用的不同系統和不同的角度研究，人們先后提出了一系列的假說[19]。但其過程主要分為3步：起始、維持和傳導。目前對PTGS的誘發機制的解釋有3種模型，即RNA閾值模型、異常RNA模型、雙鏈RNA模型[20]。在這一系列模型中RNA起著非常重要的作用，它不僅是PTGS現象的啟動因子，同時也是PTGS作用的靶分子[21]。不論何種誘發因素，所導致的RNA沉默最后都匯集到dsRNA產生后對同源性較高的目標基因的mRNA降解這一過程上。

2.1 RNA閾值模型（RNA threshold model）

該模型認為，由于激發了外源基因的高水平轉錄，以至于積累到某個閾值，從而啟動了降解特定mRNA的反應，造成轉錄后水平上的基因沉默[22]。

2.2 異常RNA模型（aberrant RNA model）

這一模型認為轉基因mRNA的異常結構激活了PTGS。Dougherty等[23]認為在植物的細胞質中存在一種依賴于RNA的RNA合成酶（RdRp），能以mRNA為模板合成小片段的cRNA，cRNA與mRNA雜交，從而成為專一性作用于雙鏈RNA的RNA降解酶的底物，提出了RdRp-cRNA模型。已從番茄中發現了RdRp，體外試驗證明該酶能以RNA為模板合成cRNA[24]，在體內這些cRNA雜合到相應的mRNA上，被特異作用于雙鏈RNA的RNA降解酶降解。

2.3 雙鏈RNA模型

前面敘述的2種模型都著重于PTGS的起始，而隨著對參與PTGS的細胞成分及相關基因的深入研究，人們對PTGS作用機制有了更為詳盡的了解，現在普遍認可的機制是在上述2種模型的基礎上由Waterhouse等[25]提出的dsRNA模型 。

①dsRNA對RNA沉默機制的啟動 隨著PTGS的發現，許多理論都試圖去解釋RNA沉默的機制以及該機制的誘導因素[26～27]。現在普遍接受的觀點是dsRNA是RNA沉默的有效誘導因子，該機制通過降解特定序列的RNA發揮作用。通過使用以RNA病毒和轉基因為目標的轉基因系統，該機制首次在植物中得到了證實。Waterhouse等[28]發現單獨表達正義或反義的馬鈴薯Y病毒（PVY）蛋白酶（Pro）基因的轉基因煙草對PVY沒有抗性，但是同時表達正義和反義的PVY Pro基因的雜交煙草植株則對其產生免疫；與此相類似的是表達自我互補（hairpin）的GUS轉基因在沉默GUS基因方面，其效率也遠遠高于單獨轉正義或反義的GUS轉基因；煙草中79 nt的反向重復ACC氧化酶序列可以有效地抑制ACC氧化酶的表達[29]。這一結果進一步證明，dsRNA是基因沉默的有效的誘導因子。在矮牽牛中也存在著CHS基因的沉默和相同基因的兩個或更多個轉基因拷貝的反向重復插入的聯系[30]。這種轉基因的插入方式可以通讀轉錄產生dsRNA[31]。不同情況下啟動RNA沉默的dsRNA來源不同，轉基因誘導的RNA沉默其dsRNA可以由轉基因的反向重復序列轉錄產生，也可以將目標基因的正義鏈和反義鏈同時轉入植物中雜交產生[28]，還可以通過RdRp將轉基因的異常轉錄產物轉變而成[32～33]；RNA病毒誘導的RNA沉默的dsRNA幾乎都來源于病毒復制的中間體[34]，少數像黃瓜花葉病毒（CMV），馬鈴薯X病毒（PVX）等病毒，它們復制中的dsRNA可以來自該病毒產生的異常RNA[35]；RNAi中的dsRNA則是來源于體外注射dsRNA等[9]。dsRNA在由單拷貝轉基因所引起的RNA沉默中的作用還未知，但是很可能某些轉基因，如CHS基因和Nii基因，當它們的RNA足夠多時，在它們的編碼區含有能誘導沉默的dsRNA結構[34]，另一種可能性是植物編碼的RdRp，把單鏈RNA作為模板去合成能誘導沉默的dsRNA[32～33]。至于DNA病毒，確實很難想象它的dsRNA是如何產生的。不過在它的基因組的復制和轉錄時確實偶爾有dsRNA生成，現在人們推測DNA病毒誘導RNA沉默的原因有3種情況：一種是DNA病毒的復制能力和高轉錄水平能夠導致dsRNA分子的積累；另一種是dsRNA分子中以ssRNA為模板，通過寄主的RdRp合成的；第三種可能性就是在DNA病毒侵染的細胞中，誘導RNA沉默的因子本身就不是dsRNA分子。又有研究發現，dsRNA在植物中能誘導特定序列的DNA甲基化[36～37]，從而促進異常RNA產生，進一步來強化PTGS。

②dsRNA降解成21~23 nt RNA Hamilton等[38]和Elbashir等[33]發現，有等量的正義鏈和反義鏈21~23 nt RNA存在于發生RNA沉默的植物和動物中。這暗示著，誘導RNA沉默的dsRNA很可能是這些小分子的前體物質。后來，Bernstein等[39]從果蠅（Drosophila）中分離到了一個RNase III的蛋白酶-Dicer，它能夠在體外把dsRNA降解成21~23 nt RNA[40]，21~23 nt RNA能夠特異性地攻擊目標RNA。Dicer的缺失突變會減弱果蠅引發RNAi的能力，說明Dicer是催化切割dsRNA形成小分子RNA的一個關鍵酶，而Dicer的發現有力地支持了dsRNA確實是在Dicer的催化下降解成小分子RNA。

③21~23 nt RNA是RNA沉默的特異性決定因子在轉基因植物發生RNA沉默時，發現有一種低分子量的反義RNA的持續積累，這種RNA與目標mRNA序列具有高度同源性[38]。類似大小的RNA分子也在動物執行RNAi中檢測到[41～42]，它們是與一種核酸酶一起被分離的，并且這種核酸酶是一種由多個亞基組成的復合體，即RNA誘導的沉默復合體（RISC）[13]，低分子量的RNA是和RISC結合在一起的，它首先在果蠅S2細胞中被分離到。最近的研究表明，在果蠅中，21~23 nt RNA分子對于RISC誘導的同源、單鏈RNA分子的降解是必要的，并且也足夠誘導其發生降解[43]。低分子量的RNA在RISC復合物中能夠特異性地識別ss-RNA序列。這些都表明21~23 nt RNA可能是RNA沉默的特異性決定因子。

3 PTGS是植物自然的抗病毒機制

PTGS是植物在長期進化的過程中形成的一種抵御外來病毒的防衛機制。因為：①在轉病毒基因的轉基因植物中，病毒是RNA沉默降解的靶標；②在轉基因植物和非轉基因植物內，病毒能誘導RNA沉默；③交叉保護試驗中由于誘導病毒產生的RNA沉默，而使植物對含有與之高度同源核酸序列的相近病毒的侵染具有抗病功能；④病毒表達特異的蛋白能抑制RNA沉默；⑤沉默信號的存在，也意味著RNA沉默是植物的抗病機制。在侵染細胞中產生的RNA沉默向侵染部位的前方傳導，因此，非侵染細胞接受信號后能激活自身的抗病反應，使植物系統抗病。證明病毒誘導基因沉默與植物抗病有關的 3個經典試驗：①RNA病毒介導 RMD （RNA Mediated Defence，RMD）。Ratcliff等人[45]利用線蟲傳花葉病毒屬中的番茄黑環病毒接種煙草（Nicotianasp.），該病毒攜帶與寄主植物基因序列相似的一段片段，可以誘導煙草后期出現同源依賴的抗病毒抗性。結果表明，抑制或預防病毒感染的植物體內抗性機制是存在的[46]。②DNA病毒介導RMD（RNA Mediated Defence，RMD）。Al-Kaff等[47]人用花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）分別接種含有設計成與CaMV的DNA序列同源、部分同源或完全不同源3種的轉基因油菜，結果與病毒同源的轉基因在CaMV感染下被沉默。③基因沉默信號介導RMD（RNA Mediated Defence，RMD）。Hamilton等[48]人將帶有水母綠色熒光蛋白（Jellyfish Greenfluorescent Protein，GFP）的轉基因煙草 （Nicotiana benthamiana）浸泡在帶有GFP報告基因的農桿菌菌液里，結果表明GFP轉基因的表達是沉默的。進一步試驗證明，GFP轉基因沉默與GFP信使RNA水平降低有關。沉默是一種信號分子產生的，而且核酸是通過病毒或類病毒移動的渠道在植物中移動，阻止病毒擴散。Bosher等[49]研究反義RNA是基因沉默的信號，因為只要有足夠的宿主編碼的RNA指導下的RNA聚合酶的底物，反義RNA（antisense RNA，asRNA）就能被合成，如果相關mRNA的3＇端特定部分降解，就會導致轉錄后水平的基因沉默。

4 利用轉錄后基因沉默（PTGS）防治植物病毒病研究進展

自從1986年Beachy等將TMV的外殼蛋白（CP）基因導入煙草，在世界上首次獲得了抗TMV感染的轉基因植株，隨后證明不但植物病毒的CP基因可在多種植物上產生不同程度的保護作用，病毒基因組上的其他基因，如復制酶（Rep）基因，移動蛋白（MP）基因等轉化植物后也具有一定的抗性。目前，人們已將多種病毒來源的基因轉入多種植物獲得了多種抗病毒植株，有的已經進入了商品化生產，給農業生產帶來了一定的經濟效益及社會效益。然而，人們基本上還是將病毒基因組上某一基因的一段或全部基因的cDNA構建成正義或反義結構轉入植物，所得抗病毒轉基因植物的比例和抗性程度都不高。PTGS現象的發現為植物病毒病的防治提供了新的可能。PTGS是真核生物細胞對外源遺傳因子的一種特異性的、高效率的降解機制，這種機制一旦被外源RNA分子所激活就能通過序列同源性的行為對任何胞質RNA進行降解[50]。自從首次在轉基因矮牽牛中發現RNA沉默現象以來，已發現RNA沉默是生物界中普遍存在的現象，是與植物的抗病性密切相關的過程[51]。RNA沉默的最突出的特征是它可以局部誘導，并通過韌皮部系統[52～53]傳播。盡管具體的沉默信號分子還未鑒定。但RNA降解過程的序列特定性表明，它很可能是一種核酸分子[35]。1998年Schiebel等[54]將PVY的Pro基因分別正向或反向轉入煙草中，再對轉基因煙草進行雜交，發現雜交后代含有正向或反向Pro基因的轉基因煙草中，有約15%的植物對PVY產生抗性或免疫，而同時含有正向和反向Pro蛋白的轉基因煙草，對PVY有免疫作用的植株就占轉基因植株總數的44%~54%。他們推斷很可能在同一植物細胞中同時含有正義和反義RNA（即dsRNA）是誘導煙草植株對PVY免疫的真正原因。這是在植物界中，最早發現病毒抗性能同時被表達正義和反義RNA誘導。這一發現把研究基因功能、沉默植物的內源基因以及抗病策略引向依靠同源的dsRNA誘導RNA沉默這一機制上。

隨著研究的深入，已有研究發現植物中的RNA沉默能被編碼dsRNA或自我互補的發夾RNA（hairpin RNA，hpRNA）所誘導[12，25，55]。人為設計這種類型的遺傳結構，如將目標基因的一段或全部cDNA設計成含有自我互補RNA的反向重復結構，轉入植物以后能轉錄產生hpRNA，啟動植物體內的RNA沉默，從而降解hpRNA的雙鏈區和與雙鏈同源的內源的mRNA。利用dsRNA能誘導RNA沉默從而導致與dsRNA同源的內源基因的表達受到抑制已經有幾例報道。2002年Stoutjesdijk等[56]報道了將擬南芥內源的Delta脫氫酶基因（FAD2）構建成hpRNA結構轉化擬南芥菜。發現大約有75%的轉hpRNA結構的植物，Delta脫氫酶的活性急劇下降。Liu等也通過了hpRNA介導的基因沉默技術產生了富含硬脂肪酸和油酸的棉籽油。而在利用dsRNA技術進行植物的抗病毒方面卻很少有報道。

2000 年Wang等[12]將大麥黃矮病毒-PAV（BYDVPAV）的聚合酶基因（Polymerase）構建成hp BYDV結構轉化大麥，有36%的轉基因植株對BYDV-PAV具有免疫作用。2003年浙江大學的牛顏冰博士[57]以黃瓜花葉病毒（CMV）的Fny分離物的復制酶基因（△Rep）構建成具有反向重復序列的pBluescript SK-重組質粒轉化煙草，有25/40的植株獲得對CMV的抗性；以番茄花葉病毒（ToMV）運動蛋白基因（MP）構建成具有反向重復序列的pBluescript SK-重組質粒轉化煙草，有23/47的植株獲得了對TMV的抗性。而且研究發現瞬時表達或摩擦接種的dsRNA都能啟動RNA沉默的起始，但保持則需要與目標RNA同源的細胞因子、轉基因或內源基因。2003年Anastasia[58]等用來源于PVY的CP基因構建了能夠表達dsRNA的植物表達載體，并轉化馬鈴薯，有12/15的轉基因的植株能夠產生抗性，而且對PVY的三個株系均有高度抗性。

從2003年開始，西班牙的Tenllado在這方面做了比較多的系統的研究。首先他及他的同事把辣椒輕度斑駁病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）的54 kDa蛋白區域、煙草蝕紋病毒（TEV）的HC-Pro蛋白、及苜蓿花葉病毒（AMV）的各個RNA的cDNA克隆體體外轉錄產生dsRNA，將得到的dsRNA與同源病毒摩擦接種植物葉片，發現只有與該病毒具有極高序列同源性的dsRNA才能對侵染產生干擾作用。其抗病性分析還表明，產生干擾侵染作用對dsRNA的長度、濃度都有要求，而且植物中局部導入dsRNA不能誘發系統的抗病毒反應[59]。隨后他們首次證實用含有能轉錄產生dsRNA的結構的農桿菌浸潤接種非轉基因植物葉片，所得dsRNA對植物病毒浸染具有干涉作用。并進一步證明dsRNA對目的病毒有特異抗性，證實了誘導沉默的都是RNaseIII切割dsRNA的siRNAs[60]。他們還利用缺失RNAase III的大腸桿菌HT115（DE3）菌株[61]初步建立了dsRNA的細菌生產體系和粗提取方法，研究了dsRNA粗提取物處理植物的噴灑技術，為促使細菌生產dsRNA抗病毒技術產業化應用作了一些預期工作[62]。

2006 年Zhao等[63]人根據TMV 126 kDa蛋白基因設計合成shRNA（short hairpin RNA），能有效的干擾TMV的侵染，此干擾是序列特異的，受時間和位點影響，而且必須是shRNA與TMV接種在同一葉片上，此結果開啟對植物病毒在RNAi方面治療性的新進展。

2008 年，張德詠等[64]構建了含有CMV同源基因的RNA2片段和MP基因反向重復片段的原核表達載體。利用大腸桿菌HT115（DE3）菌株中可表達產生目的dsRNA。用能夠表達dsRNA的細菌超聲波破碎后在溫室中處理煙草進行保護和治療試驗，結果表明，兩種表達dsRNA的細菌破碎液能夠誘導煙草對CMV產生抗性，保護效果試驗60 d后發病率分別為45%和60%，治療效果試驗60 d后發病率分別為75%和85%，而其他對照發病率均為100%。此結果為dsRNA的田間應用提供了研究參考。

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Progress on Post-transcriptional Gene Silencing and Anti-virus of Plant

ZHU Chunhui1,ZHANG Deyong2,LIU Yong2
(1.Department of Longping,Zhongnan University,Changsha 410125;2.Hunan Institute of Plant Protection)

The discovery,definition,mechanism,the relation with plant anti-virus of post-transcriptional gene silencing (PTGS),and controlling plant virus through PTGS are summarized.

Post-transcriptional gene silencing;Double-stranded RNA;Anti-virus

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.08.001

朱春暉（1980-），女，在職博士，助理研究員，研究方向是植物病毒分子生物學，電話：0731-84411303，13782032139。E-mail：zhuchunhuizhb@yahoo.com.cn

2009-10-09