茄果類蔬菜小孢子培養研究進展

王曉靜，梁燕

（西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌，712100）

花藥和游離小孢子培養是誘導單倍體植物的重要方法之一。把小孢子從花藥中分離出來進行培養，即小孢子培養或游離小孢子培養。與植物花藥培養相比，小孢子培養排除了花藥壁和絨黏層的影響，便于分析研究[1]。小孢子屬于單倍體，一方面易于誘變；另一方面，無論是發生顯性突變還是隱性突變，均可在當代表現出來，易于鑒定和選擇；加之，單倍體植物加倍之后即成為純合二倍體，易于目標性狀的固定和遺傳；同時，小孢子培養還具有周期短、不受氣候條件影響等優勢。就茄果類蔬菜目前的研究狀況看，在種質材料和研究方法上基本實現了世界范圍內的交流與共享，未被利用的資源日益減少；另外，隨著人們生活水平的提高及生產和研究過程中各種新問題的不斷出現，對新品種新材料的要求越來越多樣化，品種的更新速度加快。因此，小孢子培養受到育種家的高度重視。

小孢子培養始于20世紀70年代初，Nitsch和Norreel首先報道了煙草的游離小孢子培養[2]，隨后，Kyo和Harada建立了煙草的游離小孢子高效產生單倍體植株的方法[3]。在茄果類蔬菜中，番茄小孢子培養開展較早，1971年Sharp首次進行了番茄小孢子培養[4]，之后對茄果類蔬菜的小孢子培養研究陸續展開，在培養技術和方法方面做了探索和積累。下面從影響茄果類蔬菜小孢子培養的因子和小孢子培養技術兩方面進行概述。

1 茄果類蔬菜小孢子培養影響因子

1.1 供體植株基因型

基因型是影響游離小孢子培養的關鍵因素，是小孢子胚胎發生啟動與否的內在因素。其影響包括：產生單倍體的途徑、發生的頻率、形成的時間、植株的再生能力以及所形成植株單倍體和二倍體的比例等[5]。同一物種的不同亞種乃至品種在誘導率上也表現出極大的差異。Krueger-lebus培養栽培番茄的小孢子發現有的品種沒有球形胚出現[6]。袁亦楠等對夏露地番茄的小孢子進行培養，只有薯葉番茄有反應[7]。宋彥平等對茄子小孢子進行培養發現，11份供試材料中有7份材料獲得了愈傷組織，且愈傷組織形成的時期和數量存在明顯差異，最好的每蕾達到0.86個，且所需時間較短，20 d左右即可形成肉眼可見的愈傷組織[8]。

1.2 供體植株的生理狀態

供體植株的生理狀態，包括植株的發育階段及生長環境對小孢子培養時的胚胎發生具有很大影響。宋彥平等[8]研究發現，茄子在盛花期（植株主花枝和一級側枝的花蕾少量開花到一級側枝的花蕾已有開花之前）采摘的適宜花蕾，胚誘導率最高，始花期誘導率有所下降，末花期更低。小孢子的誘導率還與供體植株的成長條件有密切的關系。Nitsch[9]的研究結果表明，將栽培番茄和細葉番茄的生長溫度控制在22℃（晝）/20℃（夜），能將小孢子培養至子葉胚階段。張子君等[10]在對辣椒小孢子培養的過程中發現，在日溫25℃左右、夜溫13℃左右的環境中生長的植株，其再生植株誘導頻率最高，日溫超過30℃時，誘導頻率下降。另外，對供體植株施行氮饑餓及植物生長調節劑（如NAA）處理，可提高煙草小孢子胚的誘導率[11]。有人認為這些條件改變了植物體內的營養合成或運轉，使處于發育中的小孢子由于遭受氮饑餓，偏離了配子體方向而向孢子體方向發展。

1.3 花粉的發育時期

被子植物的花粉發育歷經四分體時期、單核期（小孢子階段）、雙核期和三核期（雄配子體階段）四個階段，單核期又可分為單核早期、單核中期、單核晚期[12]。一般所處發育期越早的花粉，對培養條件的要求越苛刻，且培養效果不一定好。就多數植物而言，單核中期至晚期的花粉最容易形成胚狀體或愈傷組織。同樣，對于茄果類作物，最適合小孢子培養的時期是單核期到雙核期，特別是單核后期。連勇等[13]在茄子小孢子培養的試驗中觀察到僅單核期的小孢子有分裂現象，并在隨后的誘導培養中得到大量愈傷組織。另外，由于發現小孢子發育時期與花蕾的長度有一定的關系，所以通過花蕾的長度來判斷小孢子發育時期是常用的方法，王燁等[14]認為，進行辣椒小孢子培養時選擇花蕾的標準是：花蕾的萼瓣等長或瓣稍長于萼，并且內部花藥尖端微紫。各個品種的花蕾在這個發育階段時其內部的小孢子大部分處于單核期。但是花蕾的大小與供體植株的基因型、生長條件以及花蕾在植株上所處的位置有關，因此，要想成功的進行小孢子培養，就必須了解小孢子在特定環境下的發育狀況，對小孢子進行鏡檢，將細胞學觀察與植物學相結合進行取材。

2 茄果類蔬菜小孢子培養技術

2.1 預處理

在游離小孢子前對花蕾或花藥進行預處理，有利于提高小孢子胚的誘導率。這主要是從形態上改變其極性分布，從生理生化上改變其細胞生理狀態，從而使小孢子偏離正常的配子體發育途徑，經過不斷地細胞分裂，形成胚狀體或愈傷組織，最終成苗[15]。預處理方式主要包括低溫（通常4℃）、高溫（通常36℃）、甘露醇、秋水仙素、無碳源、射線等。Duncan等[16]認為，低溫可以延緩花粉的退化，使更多花粉有可能開始新的細胞周期。Burgin等[17]用低溫處理煙草花蕾后，小孢子分裂指數上升。袁亦楠等在番茄游離小孢子培養中發現，供體植株處于低溫環境下，小孢子類胚發生率提高。Rotino等[18]驗證了溫度的高低及處理時間長短都對愈傷組織的誘導率有顯著影響，高溫處理或低溫和高溫交替進行的變溫處理對茄子愈傷組織的誘導都有一定的效果。Nitsch等用3℃的低溫處理細葉番茄花蕾48 h，可以明顯提高兩核花粉粒的百分率。王燁等[14]對5個不同的辣椒品種進行甘露醇預處理發現濃度為10 g/L時，小孢子存活率有所提高。Miyoshi[19]研究結果表明，饑餓處理對于茄子雄核發育的啟動有較好的效果。

2.2 培養基

①基本培養基 培養基的選擇是關系到成苗與否的一個重要因素。對于游離小孢子培養的基本培養基成分，不同的作物有不同的要求。就目前的研究，用于分離小孢子的分離液主要借鑒于原生質體的分離液，培養基主要借鑒同種植物花藥培養的培養基。辣椒上應用的培養基有MS、H、NTH、B5、Nitsch、N6等[20]，其中MS和NTH取得了較好的效果。茄子小孢子培養應用的培養基有 KM、MS、NLN、C、R等，其中以KM的效果較好且應用廣泛[21]。番茄小孢子培養應用到MS、HN、PM以及MH等培養基[22]。

②碳源 糖的種類和濃度對培養基的滲透壓起決定作用。應用于小孢子培養的碳源主要包括蔗糖、葡萄糖和麥芽糖。馬欣等[5]對茄子培養的試驗結果表明，葡萄糖在3種糖中的效果最好。王燁等[14]對辣椒小孢子進行了3種糖的處理，發現3%的麥芽糖效果最好。周廣棟等[23]用3%的蔗糖誘導不同品種的番茄，收到一定的效果。在游離小孢子的培養基中加入高濃度的蔗糖對胚的形成會產生抑制作用。一般認為，茄科植物游離小孢子培養所需的碳源濃度都較低，范圍在2%～4%。

③有機添加物 在小孢子的發育過程中，培養基中的有機物成分是必不可少的，它們有利于胚胎的發生。王立浩等[24]研究發現硝酸銀可以減輕辣椒組織培養中材料的褐化程度，促進胚狀體的發生。活性炭加入培養基，通過平衡培養基中元素比例進而促進胚狀體的形成[25]。王玉英等[26]認為添加0.5%的活性炭是有益的。王燁等[14]的研究表明，水解酪蛋白、Vb1、谷氨酰胺、活性炭和硝酸銀這4個因素在小孢子發生愈傷組織和成胚的過程中都起著非常重要的作用。在茄子小孢子培養中常用花藥壁與小孢子進行短期的共生培養。范適[27]用花藥壁殘渣與茄子游離小孢子共生培養7 d，取得了較好的試驗效果。馬欣[28]進行了茄子花藥壁和子房與小孢子的共生培養，結果花藥壁與小孢子共生培養7 d獲得了大量的愈傷組織。

④激素 在小孢子培養過程中，激素的種類及配比是影響誘導頻率的又一個關鍵。6-BA、KT、NAA、IAA、2，4-D等不同濃度的配比都曾試用在茄果類的小孢子培養中。Matsubara等發現[29]，在MS培養基上附加KT 0.02 mg/L+2，4-D 0.004 mg/L可誘導胚狀體高頻率發生，當附加2，4-D 0.03 mg/L+KT 0.1 mg/L時則誘導愈傷組織高頻率發生。宋彥平等[8]以KM為基本培養基，附加不同濃度激素，研究激素濃度對茄子愈傷組織誘導的影響，結果表明，最適宜的組合為0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/L NAA。然而，袁亦楠在對番茄的小孢子培養試驗中發現，在不加激素的培養基上與加了IAA的HN培養基相比，一樣能誘導類胚狀體的形成，似乎類胚狀體的形成與激素無關，但是以往的試驗報道及試驗發現愈傷組織的形成無一例外是發生在含有激素的培養基中。

⑤培養條件 植物離體培養的條件包括溫度、濕度和光照。由于采用液體培養基，容器內的相對濕度幾近100%，所以主要是調控培養溫度和光照。不少植物的小孢子在較高溫度下培養效果較好，特別是最初幾天經歷一段高溫培養出愈率會明顯提高。對于茄果類蔬菜，在32℃左右培養8～10 d，然后轉入25～28℃培養較為適宜。短期的高溫培養不但可以提高出胚率，還有利于愈傷組織的綠苗分化。在培養過程中前期主要采用黑暗培養，后期進行適當的補光，因為黑暗有利于愈傷組織的生長，但長期黑暗會明顯降低愈傷組織的品質和外觀[30]。

3 茄果類蔬菜小孢子培養的現狀與展望

綜上所述，就茄果類蔬菜小孢子培養研究結果而言， Supena 等[31]、Miyoshi[32]、高秀云等[23]分別獲得了辣椒、茄子、番茄的小孢子再生植株，但數量極少。目前茄果類蔬菜小孢子培養獲得再生植株的報道很少，大多試驗停留在愈傷組織或類胚狀體階段。存在的主要困難是小孢子會在游離后迅速大量死亡，小孢子胚誘導頻率低，胚狀體發育能力差，難以分化形成小植株。

就培養技術研究而言，由于茄果類蔬菜的小孢子培養技術難度大，發展非常緩慢，目前大多試驗主要研究的是材料的預處理方式和培養基中添加物的成分及濃度兩方面的內容。

茄果類蔬菜小孢子培養已經取得了一定的進展，針對目前研究中存在的問題，今后應該從基礎理論及試驗技術2方面著手，尤其是對取材時期、激活處理方法、培養基成分、生長環境下小孢子發育的生理機制等進行更加深入的研究，以期建立一個系統而又完善的小孢子培養技術體系。鑒于單倍體育種的顯著優勢，相信茄果類蔬菜小孢子培養技術將在基礎研究領域發揮更大的作用，與此同時，也為茄果類蔬菜品種資源的不斷更新提供有力的技術支持。

[1]孫敬三.植物細胞工程實驗技術[M].北京：化學工業出版社，2006：140-141.

[2]Nitsch C,Norreel B.Effect d'um choc technique sur lepouvoir embrygenose du pollen de Datura innoxia cultive dansl'anthere ou isole de l'anthere[J].C R Acad Sci,1973,276:303-306.

[3]Kyo M,Harada H.Studies on conditions for cell division and embryogenesis in isolated pollen culture of Nicotiana rustica[J].Plant Physiol,1985,79:90-94.

[4]Raskin R S,Sammer H E.The use of nurse culture in the development of haploid clones in tomato [J].Planta，1972,104：357-361.

[5]馬欣，申書興，連勇，等.茄子花藥和游離小孢子培養技術研究進展[J].長江蔬菜，2006（7）：39-41.

[6]Krueger-Lebus S,Potrykus I,Imaamura J.Lycopersicon esculentum:globular embryos from microspores and calli from diploid protoplasts 6th international[J].Protoplast Symposium，1983(45):46-47.

[7]袁亦楠，朱德蔚，連勇，等.番茄游離小孢子培養形成胚狀體的初步研究[J].農業生物技術學報，1997，7（1）：85-88.

[8]宋彥平，申書興，王彥華，等.茄子游離小孢子培養獲得愈傷組織的研究[J].河北農業大學學報，2007（3）：32-35.

[9]Nitsch C.Histophysiologie vegetale-premiers sur la culture in vitro de grains de pollen isloes chez la Tomate[J].C R Acad Sci,1973:1 281-1 286.

[10]張子君，徐礦紅，田云，等.辣椒花藥培養誘導胚狀體成苗[J].遼寧農業科學，2000（4）：43-45.

[11]Gresshoff P M,Doy C H.番茄單倍體的發育和分化[C]//中國科學院北京植物研究所編譯.單倍體育種集：第2集.北京：科學出版社，1972：142-153.

[12]程玉瑾，吳定華，陳國菊，等.番茄單倍體植株減數分裂的研究[J].華南農業大學學報，2000，21（4）：12-14.

[13]連勇，劉富中，陳鈺輝，等.茄子體細胞雜種游離小孢子培養獲得再生植株[J].園藝學報，2004，31（2）：233-235.

[14]王燁，張寶璽，連勇，等.不同預處理對辣椒小孢子存活率的影響[J].中國蔬菜，2004（4）：4-6.

[15]郭向榮.大麥小孢子脫分化啟動中的預處理效應及其胚胎發生[D].北京：中國科學院遺傳研究，1995，28-34.

[16]Duncan E J,Heberl E.Effect of temperature shock on nuclear phenomena in microspores of Nicotiana tabacum and consequently on plantlet production [J].Protoplasma,1976,90(3):173-177.

[17]Burgin J P,Nitcsh J P.Obtention de Nicotiana haploids apartir determine cultivars[J].Ann Physiol Veg,1967,9:377-382.

[18]Rotino G L,Falavigna A,Restaino F.Production of anther-derived plantlets of eggplant[J].Capsicum Newsl，1987(6):89-90.

[19]Miyoshi K.Callus induction and plantlet formation through culture of isolated microspores of eggplant(Salanu mmelongenaL.)[J].Plant Cell Reports,1996,15(2):391-395.

[20]李怡斐，劉廣霞，王吉慶，等.辣椒小孢子培養研究進展[J].河南農業科學，2008（10）：19-23.

[21]顧淑榮.茄子（Solanum melongenaL.）花粉粒培養獲得植株[J].植物學報,1979,21（1）:30-35.

[22]高秀云.番茄花藥離體獲得植株[J].園藝學報，1980，7（4）：27-41.

[23]周廣棟，王秀峰，謝冰，等.番茄花藥離體培養中低溫預處理對小孢子發育的影響[J].中國農學通報，2005，21（2）：192-195.

[24]王立浩，張寶璽，郭家珍，等.辣椒花藥培養中若干影響因素的研究[J].園藝學報，2004，31（2）：199-204.

[25]周旭紅，莫錫君，吳旻，等.花藥培養的研究進展[J].江西農業學報，2007，19（8）：74-76.

[26]王玉英，李春玲，蔣鐘仁.辣椒和甜椒花藥培養的新進展[J].園藝學報，1981，8（2）：41-45.

[27]范適.茄子小孢子培養研究[D].長沙：湖南農業大學，2003.

[28]董艷榮，龔義勤.茄果類蔬菜花藥和花粉培養研究進展[J].長江蔬菜，2001（5）：30-32.

[29]Matsubara S,Hu K,Murakami K.Embryoid and callus formation from pollen grains of eggplant and pepper by anther culture[J].Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1992，61:69-77.

[30]劉慶昌，吳國良.植物細胞組織培養[M].北京：中國農業大學出版社，2002：131-132.

[31]Supena E D,Suharsono S,Jacobsen E,et al.Successful development of a shed-microspore culture protocol for doubled haploid production in Indonesian hot pepper(Capsicum annuumL.)[J].Plant Cell Rep,2006,25:1-10.

[32]杜永臣，嚴準.番茄育種研究主要進展——文獻綜述[J].園藝學報，1999，26（3）：161-169.