西瓜多倍體研究應用進展

王友平，朱金英，徐光東，王磊，張洪勇

（德州市農業科學研究院，山東德州，253015）

西瓜多倍體研究最早始于日本，自1937年勃萊克斯利（Blakslee）和艾弗瑞（Averry）發現秋水仙素誘導染色體加倍效果以后，掀起了用秋水仙素誘變多倍體育種的熱潮。日本木原均和山下孝介于1939年發表關于獲得四倍體西瓜的報告，由此進入了多倍體西瓜育種的新時代。1947年木原均、西山市三發表“利用三倍體的無籽西瓜之研究”，正式宣告了三倍體無籽西瓜的育成。我國內地從20世紀50年代末開始多倍體西瓜的研究，雖起步晚但發展快、成績顯著。江蘇省農業科學院最早開始進行多倍體西瓜育種工作，1957年首次誘變成功我國第一個四倍體西瓜華東24四倍體，并以之為母本獲得三倍體無籽西瓜新秋3號。1963年中國農業科學院果樹研究所瓜類室育成無籽西瓜品種無籽3號[1]。

1 西瓜多倍體誘導途徑

1.1 自然突變形成多倍體

自然突變有無性和有性兩種方式。無性方式是自然界的二倍體在減數分裂過程中偶然發生的染色體加倍而產生多倍體，然后通過選育手段和繁殖手段培育成多倍體植株，如芽變。有性方式是小孢子母細胞或大孢子母細胞減數分裂過程中染色體未減數形成了2n配子，經雜交或直接形成多倍體種子產生多倍體植株。一些自然現象如雷電、空氣、溫度劇變、土壤中的化學物質，西瓜植株創傷等有時能誘發多倍體。但自然突變的發生頻率低，生產上主要利用人工誘導。

1.2 人工誘導獲得多倍體

①物理方法誘導 高溫、低溫、離心、超聲波和射線等都可誘導多倍體形成。但此類方法由于誘導率低、嵌合率高、為害性大（射線）而逐漸被淘汰[2]。

②化學方法誘導 與物理誘變相比，化學誘變育種具有用時短、后代穩定快、方法簡便、易推廣等優點。化學方法誘導是主要利用化學藥劑（如秋水仙素、吲哚乙酸、有機砷制劑等）進行誘導，目前主要應用秋水仙堿，它能阻止正在分裂的植株細胞內紡錘絲形成，但在藥效消失后又能恢復常態，重新進行分裂而形成多倍體。傳統的秋水仙堿誘導多倍體的方法主要有：浸泡法、滴芽法、羊毛脂涂抹法。用秋水仙堿誘導多倍體，一般要注意藥劑濃度、處理時間、細胞分裂時期和植物生長的一般狀況。其中處理濃度和時間是關鍵，處理西瓜的有效濃度為0.2%～0.4%。經秋水仙堿處理后，一般變異率只有1%左右[3]。

另外，除草劑類藥劑也取得了較好的效果。二硝基苯胺類除草劑作為染色體加倍的誘導劑，是通過干擾紡錘體形成而抑制細胞分裂中期的有絲分裂，在離體染色體加倍情況下對微管蛋白的作用比秋水仙素更有效[4]。張興平[5]以抗微管形成的除草劑在西瓜染色體加倍上進行了試驗研究，認為秋水仙堿并非最佳加倍誘導劑；用低濃度的（15～30 μmol）重氮除草劑（如Oryzalin）也可有效誘導西瓜染色體加倍，而且這類除草劑與紡錘絲蛋白的結合專一，對染色體損傷小，引起其他變異的幾率比秋水仙堿小，在這些再生植株中不存在嵌合體和植株生長延遲現象。閻志紅等[6]以3種二硝基苯胺類除草劑：胺黃靈、二甲戊樂靈和氟樂靈作為誘導劑，在離體條件下進行西瓜四倍體的誘導，誘導率比秋水仙素高。

誘導方法可分為活體誘導和離體誘導兩種。活體誘導處理部位為種子、幼苗莖尖、幼苗生長點等，誘變率一般在0.1%～1%。譚素英等[7]通過剝去生長點外幼葉后用1%秋水仙素的羊毛脂膏涂抹和0.2%的秋水仙素水溶液浸芽處理，變異頻率分別達到61%和52.6%，顯著提高了西瓜變異頻率和秋水仙堿處理效果。徐道娜等[8]對3個二倍體西瓜種質進行秋水仙素滴苗、不同苗態摘心、低溫等綜合處理誘變多倍體。結果表明，通過對各個單因素進行試驗，秋水仙素濃度為0.2%～0.4%，對西瓜幼苗進行摘心處理誘變能顯著提高多倍體的誘變率。但傳統的活體誘導處理方法具有誘變率低、嵌合率高，且獲得的四倍體植株稔性低，并可能發生回復突變等缺點，而離體培養過程中應用誘變劑的誘導技術能夠克服活體誘導技術的缺點。馬國斌等[9]把8 d左右苗齡的莖尖，接種在含有0.1%秋水仙素和較低濃度細胞分裂素的液體培養基中，處理24～48 h進行誘導，最有利于四倍體的產生。周謨兵等[10]試驗結果顯示，誘導西瓜四倍體較好的方法是將1 000 mg/L的秋水仙素加入到培養基中處理6 d，再接種到不含秋水仙素的培養基中使其分化成苗，四倍體的誘導率平均可達到55%。

③生物學方法 通過愈傷組織和組織培養染色體加倍獲得多倍體，或是傳統雜交方法，生產上用四倍體西瓜作母本，二倍體西瓜作父本進行雜交獲得三倍體無籽西瓜：也可以用四倍體西瓜作父本，二倍體西瓜作母本雜交獲得無籽西瓜。還可以用四倍體西瓜直接進行雜交，生產四倍體雜交一代西瓜。

2 西瓜多倍體的鑒定方法

2.1 染色體直接計數法

染色體直接計數法是最直接、最準確的鑒定方法。觀察誘變株的根尖或花粉母細胞的染色體數目，西瓜三倍體染色體數目2n=3x=33，西瓜四倍體染色體數目（2n=4x=44）。郭啟高等[11]在離體培養過程中，用不定芽葉尖染色體數目判斷倍性，可以在組織培養早期100%檢出西瓜植株倍性，且僅經預處理和固定即可涂片觀察，省略了低滲、酶解等大量繁瑣過程，方法簡單，結果可靠，節約了大量的時間和培養基，并可根據需要將不同倍性的材料轉入分化培養基中進行擴繁，更能適合工廠化高效育苗的需要。

2.2 流式細胞測定法

采用掃描細胞光度儀（也叫倍性分析儀）進行鑒定，用流式細胞測定法迅速測定葉片單個細胞核內DNA含量，根據DNA含量的曲線圖推斷出細胞的倍性。特別是在離體培養過程中，試管中的芽或植株很小且很嫩時，很容易決定其材料倍性，從而能快速地在試管苗時期進行染色體倍性分析。該方法可迅速測定細胞核DNA含量和細胞核大小，是大范圍試驗中鑒定倍性的快速有效的方法，且細胞核DNA含量不受外部因素，如光密度、植物組織水含量的影響，不受植物取材部位和細胞所處時期的限制，可以是葉片、莖根、花、果皮或種子等。如Zhang等[12]用此法來鑒定西瓜倍性，但該法測定費用較高。

2.3 細胞形態學鑒定法

劉文革等[13]利用掃描電子顯微鏡對不同倍性西瓜花粉粒形態進行了系統觀察。結果表明，二倍體花粉多為近長球形，花粉整齊一致；四倍體花粉為圓球形，有異形花粉、粘連花粉和空癟花粉等；三倍體花粉全部為空癟花粉。譚素英等[7]研究發現，西瓜葉片保衛細胞的大小、單位面積上的氣孔數及保衛細胞中葉綠體的大小和數目與倍性具有高度的相關性。 Sari等[14]、Mccuistion 等[15]報道，根據保衛細胞的大小、單位面積上的氣孔數及保衛細胞中葉綠體的數目，可以有效區分倍性。Compton等 、劉文革等[17]用二乙酸鹽熒光黃涂抹在西瓜離體幼葉的下表皮上，在顯微鏡和紫外光下觀察保衛細胞葉綠體的熒光，二倍體和四倍體的每對保衛細胞的葉綠體數目平均為9.7和17.8。Cohen等[18]認為用氣孔長度比其他方法都簡單易行，不需要昂貴的設備，僅需要用膠帶揭掉表皮，用塑料印膜印記即可，采用測定氣孔保衛細胞的大小與染色體數目檢驗法相結合的方法，可以快速準確地篩選出加倍植株。

2.4 分子生物學鑒定法

隨著分子生物學技術的發展，人們開始從分子水平入手研究多倍體，對其倍性、來源進行鑒定。目前分子技術主要應用在西瓜多倍體育種中植株種子材料的選擇、幼苗的純度鑒定等領域。劉文革等[19]以蜜枚和JM西瓜品種的純合二倍體及其人工誘導的同源四倍體、三倍體為材料，對不同倍性西瓜AFLP標記的分子遺傳變異進行了比較。其中，蜜枚品種西瓜具有3條多態性的條帶，四倍體、三倍體和二倍體各有一條特異帶；JM西瓜具有7條多態性的條帶，3條為M4x特有帶，2條為 JM3x特有帶，2條為JM2x特有帶。劉文革等[20]以蜜枚和JM西瓜品種的純合二倍體及人工誘導的同基因型的同源三倍體、四倍體植株為材料，對其植株葉片的光合色素進行了測定。結果表明，按單位鮮質量測定光合色素，2個品種的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量總的趨勢是隨著染色體倍性的增加而減少，不同染色體倍性之間差異顯著；而葉質量、單葉面積、單位葉面積的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量是隨著染色體倍性的增加而增加。

2.5 雜交鑒定法

利用反交法，以待鑒定的誘導植株為母本，已知二倍體植株為父本進行套袋隔離雜交，單瓜留種，結果表明：采用雜交鑒定法判斷四倍體變異株的準確率達到100%。而且利用此法當代即可確認四倍體并獲得三倍體，可以免去工作繁瑣復雜的染色體記數法[21]。

2.6 植株形態學鑒定法

形態學鑒定法又稱間接鑒定法，是最直觀的鑒定方法。湖南農學院遺傳、蔬菜教研室在1980年報道，多倍體西瓜幼苗表現粗壯，節間較短，分枝力差；葉片鈍圓，小而厚，茸毛較多，顏色深，葉緣多鋸齒；花色較濃，花粉粒較大，孕性較二倍體低，有的甚至完全不孕，抗性增強，外果皮增厚，果實比二倍體小，呈圓形或多角形，果肉厚，肉質較緊密；種子少而大，種仁不飽滿，臍部寬，種皮厚且硬[22]。龔由瀾等[23]曾比較得出，新誘變成的西瓜四倍體的葉片厚度比誘變親本二倍體的葉片厚度大2.43倍。Compton等[24]研究發現子房直徑、雌花的花瓣和花粉囊直徑、葉長與葉寬是西瓜倍性水平高低的標志，四倍體子房直徑是二倍體子房直徑的1.4倍。

2.7 逆境脅迫法

郭啟高等[25]利用增殖系數法、高溫脅迫法（50℃，10 h）和低溫脅迫法（0℃，5 h），檢出倍性平均符合程度分別為88%，90%，80%。本法省掉了獨立的單株倍性鑒定過程，只需對大批量的再生苗一次性地做短時間處理后，即可檢出四倍體，體現了早、快、好、省的優點。在檢測的同時，還能快速擴繁出大量四倍體再生苗，尤其對增殖系數法來說，擴繁出的二倍體還可做為三倍體無籽西瓜雜交翻種的親本。可謂是一條西瓜多倍體工廠化育苗的快捷之路。

3 多倍體西瓜的研究及應用

3.1 多倍體西瓜的研究

①品質研究 程志強等[26]以10個西瓜品種的二倍體及其人工誘導的同源四倍體、三倍體為材料，研究了不同倍性西瓜成熟果實VC含量的差異及果實發育過程中VC含量的變化。結果表明，不同倍性西瓜中VC含量差異較大，9個品種三倍體或四倍體的VC含量高于二倍體（P<0.05）；不同倍性西瓜果實發育過程中VC含量變化規律基本相同，幼果期較高、果實膨大期較低、成熟期較高且呈近似“V”形變化曲線。其峰值的出現順序為2x、3x、4x，倍性越高，其峰值出現越晚。不同染色體倍性西瓜果實VC含量較高的時期均為成熟期。

②耐鹽性研究 劉文革等[27]用NaCl瓊脂固定法對蜜枚西瓜二倍體、三倍體、四倍體在不同濃度NaCl脅迫下發芽種子成苗率、下胚軸長、根長、側根數等指標進行了測定，在30～60 mmol/L低濃度下，不同倍性西瓜所測指標都比對照高，低濃度鹽分脅迫，有助于根系和幼苗生長，倍性之間沒有明顯差異；在90 mmo1/L以上濃度時，不同倍性之間有明顯差異，耐鹽性為M4x>M2x>M3x。M4x可耐受150 mmol/L濃度的鹽分，M2x可耐受l20 mmol/L，M3x可耐受90 mmol/L。四倍體的耐鹽程度更高些，可能和其基因劑量效應有關，三倍體的耐鹽程度差，可能和三倍體種子發育不良有關[28]，其耐鹽機理有待于進一步研究。

③耐冷性研究 劉文革等[29]以蜜枚二倍體及其人工誘導的同源四倍體、三倍體為材料研究了西瓜品種的不同倍性幼苗在冷脅迫下的冷害指數、細胞保護酶 （SOD、POD）及脯氨酸 （PRO）、丙二醛（MDA）的變化。結果表明，在沒有冷誘導時，M4x、M3x的耐冷性不如M2x。隨著冷脅迫時間的延長，SOD、POD活性都有所增加，M2x比M4x、M3x增加幅度大，最后下降。MDA含量變化呈相反的趨勢。M2x的體內活性氧積累少，表現出比多倍體耐冷。PRO含量變化M2x、M3x先上升，4 d后表現下降，M4x的PRO含量從開始就表現下降，四倍體的耐冷性降低可能是細胞的生理狀況的改變諸如水分含量的增加引起的。

3.2 西瓜多倍體的應用

①三倍體無籽西瓜的培育 多倍體育種在西瓜上應用最廣泛，成效也比較明顯，最顯著的為三倍體無籽西瓜的培育。我國進行多倍體西瓜培育最早的是江蘇省農業科學院，于1957年首先育成了華東24號四倍體西瓜，并配制三倍體無籽西瓜新秋3號。1961年后中國農業科學院果樹所和鄭州果樹所也進行了四倍體和三倍體西瓜的選育，現已育成的四倍體品種（系）和三倍體品種已超過100個。由于三倍體西瓜無籽的特點，到目前為止培育三倍體無籽西瓜仍作為西瓜育種的一個目標。

②利用多倍體獲得高產優質西瓜 由細胞染色體加倍而帶來的性狀變化是非常有利的。多倍體最明顯的特征是“巨大性”，生產上利用多倍體可以提高產量和品質、增加抗病抗逆能力；西瓜通過人工誘變成為四倍體后，某些性狀比二倍體更加優越，例如果皮增厚不易開裂，更耐儲運；甜度增加；植株維持綠色的時間更長；果肉中營養物質含量提高等。番茄紅素是一種有較強的防癌抗癌作用的類胡蘿卜素。Perkins等人對不同倍性西瓜中的番茄紅素含量測定結果表明，三倍體紅瓤無籽西瓜中番茄紅素含量顯著高于二倍體紅瓤西瓜。在多倍體抗性方面，可進行耐鹽性、耐低溫、抗病品種選育，例如枯萎病是西瓜生產上一種毀滅性病害，三倍體和四倍體西瓜對枯萎病表現出較高的抗性。

③種質材料創新 由于染色體結構和數量的變異以及基因突變，四倍體西瓜及原始四倍體在若干世代中分離出的不同類型均是重要的種質資源。在西瓜的多倍體育種中，已獲得了西瓜四倍體的短秧系、無缺刻葉系、黃系、無杈系、雄性不育系等種質材料。

4 前景展望

①多倍體育種、遠緣雜交與組織培養相結合。多倍體育種與遠緣雜交相結合，向來被育種家推崇為一種好的育種途徑，但遠緣雜交的不育性和常規人工誘導多倍體的困難限制了這種結合的進行，隨著組織培養技術日臻成熟和完善 （如細胞培養、胚胎培養和體細胞雜交等技術的成熟），使得多倍體、遠緣雜交和組織培養三手段的結合成為可能，并顯示出巨大的潛力。原來不能利用的野生資源得以利用，而由于染色體的加倍量變引起質變，常規育種資源得以創新。許多優良基因經過重組和加倍可以結合于同一品種中。不同方法的結合并用，取長補短，從而推動了科研工作的發展。

②由于多倍體基因和基因組的變化會導致基因表達發生相應的變化，目前我們還不完全了解改變基因表達的機制以及它們對進化的影響。而且只有對基因表達變化的研究更加詳細，才能發現很多多倍體中新的變異的動力學及其對多倍體進化的影響。

③在生物多倍體誘變方法中，采用物理、化學、生物等方法相結合進行多倍體誘導的報道不多見，新方法的采用也很少報道，這些方面的研究值得深入。

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