端粒和端粒酶在乙型肝炎、肝硬化和肝癌中的研究現狀*

王麗華 綜述 朱傳武 陳 明 審校

端粒是真核細胞染色體末端的重要結構，端粒酶是維持端粒長度的RNA依耐性DNA聚合酶。近年來，在基礎和臨床研究方面對端粒和端粒酶進行了大量的研究，并取得了較大的進展，現綜述如下。

一、端粒的結構與功能

端粒是線性染色體末端的核蛋白結構，其功能是防止染色體發生末端融合和重組。在大多數器官里，端粒DNA是富含鳥苷酸的簡單串聯重復序列（TTAGGG），四個TTAGGG重復序列折疊成一個G-四倍體。對于端粒酶而言，這是一個惰性底物，這種特性不但為抑制端粒酶的活性提供了分子機制，而且更多地影響了端粒的功能[1]。端粒被六種核心蛋白TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TIPP1 和 POT1 組成的復合物所保護，這種復合物稱為屏障因子，有助于防止端粒被作為DNA雙鏈缺口加以識別，發生同源重組和非同源重組并進行不恰當的修復[2]。端粒DNA最末端為一3’端單鏈突出物，稱之為G尾。在哺乳類動物細胞里，這種突出物能侵入端粒最近的區域形成一個特別的D環。重要的蛋白通過DNA與蛋白、以及蛋白與蛋白的相互作用募集到端粒上。

在缺乏端粒酶延長機制時，由于傳統的DNA聚合酶不能復制端粒，故隨著細胞的不斷分裂端粒DNA逐漸丟失。有研究[3，4]表明，單鏈端粒的缺失足以生成至少兩種早期癌細胞表型。同時，癌細胞通過激活端粒自我平衡程序獲得無限或非常大的增殖潛力。細胞培養模型研究顯示，復制衰老和端粒耗損有密切的關系，年長者端粒長度較年輕者為短，但體內端粒縮短對人類老化的影響還難以證明，包括端粒功能障礙對年齡相關的病理變化也是如此。

細胞在進化過程中已經形成對抗端粒DNA逐漸丟失的機制。在某些器官，端粒以重組的方式維持端粒長度。在另外一些器官，端粒的長度由端粒酶合成。在某些癌組織中檢測不到端粒酶，這些癌細胞使用一種非傳統的端粒延長（alternative lengthening of telomeres，ALT）方式來維持端粒長度[3]。Gatbonton等[5]發現在酵母菌中，刪除72個基因可致短端粒，而有80個基因是與野生型酵母菌的長端粒有關的。他們還發現有39個基因對端粒酶缺乏細胞的增殖或端粒長度維持起重要作用，包括參與脫氧核苷酸的生物合成，姐妹染色質的黏附，空泡蛋白分類等。

二、端粒酶的結構與功能

在細胞復制期間，由于端粒DNA末端不能復制，因此端粒長度進行性縮短。為了避免端粒過度縮短導致細胞復制終止，真核細胞在進化中形成了一種特殊逆轉錄酶——端粒酶，其功能是通過將DNA重復序列添加到染色體的3’末端以對抗端粒的持續降解。端粒酶是一種高度特異化核蛋白復合物，為端粒DNA延長提供RNA模板序列[6]，包括兩個基本核心成分，端粒酶逆轉錄酶或稱為端粒酶催化亞單位（telomerase reverse transcriptase，TERT） 和端粒酶 RNA（telomerase RNA，TR），以及幾個端粒酶相關輔助蛋白。具有催化活性的TERT蛋白使用TR成分中的短序列作為模板合成端粒DNA。人類端粒酶RNA成分包括了451個核苷酸，5’端一半折疊入保守的催化核心，組成了模板區域和附近的假結節區域[7]。TR的大小因物種的不同而差異顯著，纖毛蟲150個核苷酸（nt），脊椎動物556nt，酵母菌超過 1500nt。人們應用種系對比分析法為每個物種建立了TR二級結構模式。從纖毛蟲、酵母到脊椎類生物，TR結構共享一個模板區域附近相似的假結節結構。Feng等[8]研究發現，S.cerevisiae TLC1RNA核心區域包含了一個保守的三級螺旋結構，這種三級螺旋結構的降解造成了體外端粒酶活性的下降和體內端粒的縮短，并且與蛋白亞單位的結合力沒有改變。同時發現，三級螺旋結構接近端粒引物的3’末端與模板綁定。端粒酶RNAs三級螺旋區域的一個或多個2'-OH對催化起重要作用。Shefer等[9]在體外用用寡聚核苷酸證實了三級螺旋結構的形成，而且證實其對端粒酶的功能是必需的。但是，三倍體干擾突變廢除了端粒酶的功能，G-CC三倍體的補償突變以pH依賴的方式恢復假結節結構，并且部分恢復體內端粒酶功能。另外，一種新類型的G-CU三級螺旋結構，也能部分恢復假結節的結構和功能。Yu等[10]研究發現，纖毛端粒酶RNA基本功能結構域是四級莖環結構，可強烈地刺激端粒酶活性和轉錄加工過程。通過大量結構和功能的研究，發現這些結構特征和酶的活性殘基對TERT蛋白結合沒有明顯的影響。有研究[11]表明，Kluyveromyces lactis TER的5’臂對端粒酶功能起關鍵作用，它可能與Est3的功能有關。

David等[12]研究證實，基本的端粒DNA結合蛋白Cdc13p對芽殖酵母的端粒長度具有雙向調節作用，他們發現Cdc13p通過三種完全不同的方式抑制端粒酶的活性，包括一種新的遠距離的抑制方式。Zhang等[13，14]發現以前參與端粒長度調節的異源性核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNPA1）結合到DNA單鏈和具有人端粒重復序列的結構，擾亂了單鏈和端粒的高級結構。應用體外端粒酶實驗，觀察到hnRNPA A/B蛋白顯著下調了端粒酶活性，加入純化的重組hnRNPA可增加端粒酶活性。研究表明hnRNPA1的功能是作為端粒酶全酶的輔助因子而非必需因子。進一步研究發現，hnRNPA1與體內端粒有聯系，認為hnRNPA1通過每次轉位步驟中形成的G四級結構或G-G發夾結構的松解刺激端粒延長，G-四倍體是富含鳥苷酸的DNA序列。盡管在大多數成人體細胞中端粒酶處于失活狀態，但是在90%的人類癌癥細胞中會被再激活，并且端粒酶對端粒長度的維持是導致這些細胞持續增殖的重要機制。

三、端粒、端粒酶與免疫應答

典型的免疫應答依賴于兩種功能淋巴細胞，即T細胞和B細胞。免疫應答起始于T淋巴細胞和B淋巴細胞對抗原的識別和結合，并導致特異性淋巴細胞的大量擴增。淋巴細胞的端粒縮短到一定長度，無論發生在單倍體還是多倍體染色體末端，細胞均停止分裂并且衰老死亡或發生凋亡。端粒具有計數細胞分裂次數的功能并限制了正常體細胞分裂的次數。最近研究表明[15]，衰老的細胞與新生的細胞相比，端粒明顯縮短，一方面是由于細胞分裂后，累積的端粒縮短，另一方面是由于端粒酶活性的缺乏或不足，表明端粒在決定這些細胞的復制壽命上起重要作用。從初始T細胞分化為記憶細胞經歷多次細胞分裂導致端粒重復序列的縮短，然而這種累積的端粒縮短是否最終影響記憶T細胞的功能現在還不明確。在T細胞分化和分裂過程中，端粒損耗的速率也不清楚。T細胞端粒酶表達研究表明，在T細胞發育和分化過程中端粒酶活性明顯上調。隨著每個周期刺激后體外T細胞增殖能力下降，激活T細胞端粒酶的活性也下降。在初始B細胞分化為記憶B細胞的過程中，端粒長度沒有明顯丟失。與T細胞一致的是，在靜止的B細胞端粒酶并不表達，但在絲裂原刺激后酶的活性則迅速激活。結果表明在B細胞分化過程中，端粒酶的活性不僅能夠被調節，而且能夠延長體內端粒長度。

四、乙型肝炎患者外周血淋巴細胞人TERT（hTERT）的表達

在淋巴細胞發育、分化和激活過程中，端粒酶活性及TERT的表達明顯上調，表明端粒酶在控制淋巴細胞復制壽命中的潛在作用。淋巴細胞端粒縮短被認為是免疫衰老的標志，如果端粒酶阻止淋巴細胞端粒縮短，則對免疫功能，器官老化和癌癥的發生均起重要作用。HBV感染的外周血淋巴細胞，包括免疫細胞的選擇和T淋巴細胞凋亡的增加導致了免疫應答受損。在慢性HBV感染患者的研究中，宿主免疫功能障礙可能與hTERT有關。因此，患者外周血淋巴細胞中hTERT的表達受到了高度重視。

無論端粒酶活性如何，人類TR在所有組織均會高表達，但只有hTERT mRNA的表達與端粒酶的活性密切相關。上調淋巴細胞端粒酶的活性，可能會有效阻止分裂中的淋巴細胞發生端粒縮短，保證淋巴細胞持續增殖。如果端粒酶活性很低，淋巴細胞則不斷發生端粒縮短。因此，淋巴細胞端粒酶活性下降會影響宿主的免疫功能，這已在HIV感染的患者中得到了證實[16]，說明人類淋巴細胞端粒長度、端粒酶活性與宿主的免疫功能有關。另有研究發現[17]，HBV感染患者外周血淋巴細胞中hTERT mRNA表達比正常對照人群顯著下降，而hTERT mRNA的水平與端粒酶的催化活性密切相關，因此提示端粒酶可能間接參與了慢性乙型肝炎的免疫病理損傷。在慢性乙型肝炎患者中，hTERT mRNA轉錄表達的下降與患者的臨床狀態、年齡、性別或者丙氨酸氨基轉移酶水平無關，但其病程與hTERT mRNA的水平呈負相關。研究結果表明，慢性乙型肝炎患者淋巴細胞中較低水平的hTERT mRNA表達與慢性肝炎的免疫病理有關，這也反映了免疫系統的過早衰老，因此可能與慢性乙肝中肝癌的高發病率有關。

五、肝硬化和肝癌中端粒酶及hTERT的變化

Yao等[18]研究了端粒酶在肝癌發生中的動態變化，以及端粒酶在肝組織和外周血單個核細胞中的表達對肝癌的診斷意義。發現在肝癌的發展過程中端粒酶是呈動態變化的，在肝細胞的退化、癌前病變和癌化的各個階段，端粒酶的活性和肝臟總RNA水平一致。在肝癌患者肝組織中端粒酶水平較癌旁組織明顯增高。以較低的吸光度評價，正常對照、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌組中外周血端粒酶的陽性率分別是15.7%、25%、45.9%和85.2%。如以較高的吸光度評價，則肝癌組為60%，而其他組均為0。將外周血端粒酶和血清AFP水平相結合可顯著增加肝癌診斷的陽性率和準確度。因此，端粒酶的過度表達與肝癌的發生有關，可作為肝癌的診斷標志。

有學者[19]用實時定量RT-PCR檢測了hTERT mRNA轉錄水平、實時PCR與Southern blot檢測了hTERT、c-myc mRNA的基因表達水平。共檢測了44例肝臟結節，包括5個再生結節，14個低等級發育不良結節，7個高等級發育不良結節，11個肝癌病灶的不良增生結節，17個肝癌病灶和23個慢性肝炎或肝硬化肝臟組織，6個正常肝組織。結果發現，hTERT mRNA水平隨肝癌發生的進展而增加，大多數高等級結節所表達的hTERT mRNA與肝癌組織類似。有21%的低等級結節具有較高水平的hTERT mRNA，接近于高等級結節的水平，但在低等級結節中hTERT mRNA水平的高低與病理特征無關。提示檢測hTERT mRNA可以發現肝臟結節的癌化趨勢，肝癌發生時hTERT和c-myc mRNA的基因表達不是調節hTERT mRNA轉錄的主要機制。

六、HBV蛋白與hTERT mRNA變化的關系

Guo等[20]用免疫組化檢測30例HBsAg陽性和17例HB－sAg陰性原發性肝癌中hTERT蛋白表達，用RT-PCR法分析hTERT mRNA表達的情況，結果發現：hTERT蛋白主要分布于肝癌細胞胞質，偶爾分布于胞核。HBsAg陽性患者hTERT蛋白及其mRNA的陽性率分別是93.33%和83.33%，而HBsAg陰性患者hTERT蛋白及其mRNA的陽性率分別是 52.94%和 47.06%。表明在人肝癌細胞中，HBsAg與hTERT mRNA的表達是相關的，HBV的蛋白成分可能通過激活hTERT基因在肝細胞轉化和癌癥發生過程中起重要作用。另一項研究通過將HBV X基因轉染到人類肝癌細胞系和膽管癌細胞后，其hTERT mRNA表達上調，表明HBx基因能上調hTERT mRNA轉錄，HBx基因所致的hTERT基因激活可能是HBV感染患者肝癌和膽管癌發生的分子機制之一[21]。

Zhang等[22]檢測了34例肝癌和相應癌旁組織，30例肝硬化和6例正常肝組織，發現腫瘤組織、癌旁組織和硬化肝組織中hTERT的陽性率分別為67.6%、73.5%和100%，但在正常肝組織中未發現hTERT呈陽性。在腫瘤組織中HBsAg、HBcAg和HBxAg的陽性率分別為58.8%、26.5%和76.5%；在癌旁組織中的陽性率分別為64.7%、41.2%和85.3%；在硬化肝組織中分別為76.7%、66.7%和100%。結果顯示，hTERT表達和這些組織中HBxAg的表達無顯著差異。Western-blot分析顯示，在HBx基因短時轉染的腫瘤細胞中，c-myc和hTERT的表達比對照組要高得多；用靶區擴增多態性（TRAP）方法檢測端粒酶的活性，也得出了類似的結果。研究表明HBx上調了肝腫瘤細胞hTERT的表達，并與腫瘤的發展有關。

七、hTERT mRNA檢測的臨床意義

血清中hTERT mRNA可以作為一種新的腫瘤標志。Miura等[23]檢測了64例肝癌、20例肝硬化、20例慢性肝炎和50例健康個體血清hTERT mRNA水平，結果發現肝癌比慢性肝病患者具有更高的血清hTERT mRNA水平，hTERT mRNA的表達與腫瘤面積、數量和分化程度等變量呈現獨立相關關系。在診斷肝癌方面，hTERT mRNA的敏感性和特異性分別是88.2%和70.0%，而AFP mRNA分別是71.6%和67.5%。由于血清與肝癌組織中的hTERT mRNA是相關的，因此血清hTERT mRNA比AFP mRNA對肝癌的診斷更具優越性，可以作為一種新的、有價值的腫瘤診斷標志物。

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