丙型肝炎病毒基因型與抗病毒治療

王自林 宣 艷 王麗莉

自1989年Houghton等發現丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）至今，對HCV基因型與丙型肝炎治療的研究有了較大的進展。本文對這些問題作一簡要的介紹。

一、慢性丙型肝炎的流行狀況

丙型肝炎呈全球性流行，并逐年增加，目前全球感染率約為3%，感染者約2億人[1]，而我國一般人群抗-HCV陽性率為3.2%，有近5千萬感染者，屬HCV的中高度感染區[2]。丙型肝炎以輸血為主要傳播途徑，其次為手術（包括外科手術、牙科治療、紋身、美容等）或不潔注射（包括非一次性使用注射器的靜脈吸毒）造成的感染或性傳播。母嬰傳播率不超過6%，醫務人員注射針頭意外刺傷、公共場所共用剃須刀等也可造成散發病例發生[3～7]。在我國2004年制定的《丙型肝炎防治指南》中指出，HCV感染后50%～85%發展為慢性丙型肝炎[8]。有報道，HCV感染后20年，10%～15%發展為肝硬化；HCV相關的肝細胞癌（Hepatoceallualar carcinoma，HCC）的發生率在感染30年后為1%～3%[9，10]。肝硬化和HCC 是慢性丙型肝炎患者的主要死因，其中失代償期肝硬化最為主要。另外，由于HCV的基因變異性較大，體內產生的中和抗體難以應付不斷出現的大量的新的病毒準種，所以丙型肝炎的預防尚無疫苗可用。有報道，有效的抗病毒治療可改善患者長期生存率與生活質量[11]。因此，積極加強對HCV基因的研究，不斷提高治愈率，才能延緩及減少肝硬化和肝癌的發生。

二、HCV的基本分子生物學特性

HCV為黃病毒科單股正鏈線狀RNA，球形，有包膜。基因組全長約 9600 堿基對（bp），由兩端非編碼區（5′UTR，3′UTR）和中間一個長的開放讀碼框（Open reading frame，ORF）組成。非編碼區序列高度保守，含有核酸的二級結構，5′末端非編碼區內有內在性核糖體進入部位（internal ribosomal entry site，IRES），其功能與病毒基因的復制和基因表達的調控有關；而3′UTR對于HCV RNA復制是不可缺少的。ORF編碼一個大的前體蛋白，此蛋白可被宿主和病毒蛋白酶加工成結構蛋白（Core、E1、E2和 p7）和非結構蛋白（NS225）。編碼區分結構基因區和非結構基因區，結構基因區主要有核心蛋白基因和兩個包膜基因。非結構基因有6個，分別為NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[12]。HCV基因組呈現高度異質性，根據HCV基因組核苷酸序列的差異程度，可將HCV分為6種基因型和多種亞型[13]。根據2005年新達成的HCV基因型命名規則共識，以阿拉伯數字表示HCV基因型，以小寫的英文字母表示基因的亞型，如1a、2b、3c等表示，其中4型中就分為20個亞型。在有些地區，亞型代表了特殊的流行病學價值。因此，在流行病學調查中，為準確地鑒別基因型和亞型，并通過對兩個區（E1、NS5B）的序列進行測序和進化樹分析來確定基因型/亞型是較為理想的方案。基因型的分布存在地區差異，其中，基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70%以上。在我國，主要為1b和2a，其中以1b型為主，2a型次之。某些地區有1a、2b和3b型的報道；6型主要見于香港和澳門地區，在歐洲和日本以1b型為主，中東地區以4型常見。基因型的意義在于其與抗病毒治療效果的相關性十分密切。已有研究證明[14]，不同基因型與HCV感染后的病情變化以及干擾素的療效有一定的相關性，HCV的基因型能影響抗病毒治療的效果。因此，HCV的基因型是可靠且重要的治療反應指標。

三、抗病毒治療的目的

抗病毒治療的目的是清除或持續抑制體內的HCV，以改善或減輕肝損害、阻止進展為肝硬化、肝功能衰竭或HCC，并提高患者的生活質量。

四、基因型與抗病毒治療

分子進化分析可以鑒定不同的基因型和基因亞型。基因型、基因亞型和株間的序列異源性分別為30%、20%和10%。HCV基因分型的金標準是包膜區（E1）或非結構基因（NS5B）的序列分析，并與參考序列的比較以及分子進化分析。臨床上應用基因特異性寡核苷酸探針或限制性片段長度多態性分析對HCV的NS5B和E1區域進行測序來確定HCV基因分型[15]，兩種方法均已標準化，能夠測定HCV的6個基因型和一系列亞型，對基因型的檢測誤差不多，但基因亞型的分型誤差約為10%～25%，與所選擇測定的基因區（5’NTR）有關。由于只有基因型與臨床的關系密切，所以亞型的分型錯誤對臨床影響不大。檢測不同基因型的特異性抗體也可以進行基因分型，但不能區別不同的基因亞型，對基因1型的檢測效果優于其它基因型。對于血清學方法與分子生物學方法檢測結果不一致的感染者，以E1或NS5B區基因的序列分析結果為主。

根據AASLD丙型肝炎防治指南，干擾素和利巴韋林的聯合治療仍然是治療丙型肝炎的最佳標準方案，可以使多數急性患者和40%以上的慢性患者肝功能長期正常，HCV RNA長期陰性，癥狀完全消失，達到治愈或接近治愈的效果。影響干擾素療效的主要因素包括HCV干擾素敏感性決定（ISDR）氨基酸突變數目、血清HCV RNA水平以及肝組織病理學改變程度。對于HCV 1b型和2a型，ISDR突變是患者對干擾素產生持續性應答的預測因素，且隨著突變數目的增加，尤其是其特定位點氨基酸（如 2209、2216、2218、2227）的突變，應答率不斷升高，但在HCV 1a、3a和2b型中未發現與干擾素療效有關的氨基酸序列[16，17]。現正開發中的新藥物主要有以下幾種[18，19]：HCV蛋白酶抑制劑，包括NS2-3蛋白酶和NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑；HCV解旋酶抑制劑；HCV NS5B RNA聚合酶抑制劑；p7離子通道抑制劑，如金剛烷胺；HCV IRES抑制劑，以阻斷HCV蛋白的翻譯；免疫調節劑，以提高機體的免疫反應如白細胞介素12，或減輕炎癥性肝損傷如白細胞介素10。但這些新藥物的有效性、安全性以及是否可造成HCV的耐藥性變異等方面尚須進一步研究，因而近期內很難應用于HCV感染者的治療。

熒光定量PCR檢測HCV RNA不僅可以在抗-HCV陽轉前及時地早期發現感染者，而且能夠明確抗-HCV陽性的感染者體內HCV的復制水平，以便確定是否需要進行抗病毒治療，或預測及評價抗病毒治療的效果，具有重要的實用價值及臨床意義[20]。對于急性丙型肝炎患者予以單劑常規干擾素治療是有效的。但是，病毒學檢測對于決定是否進行干擾素治療、治療的劑型、劑量和療程都沒有特殊的價值。HCV基因分型檢測在決定療程方面有重要的意義。干擾素治療對丙型肝炎相關肝硬化的自然史的影響是肯定的，丙型肝炎抗病毒治療的目標應該是持續病毒學應答（sustained virus response，SVR），雖然丙氨酸氨基轉移酶（ALT）正常和組織學改善也可以改善自然史和臨床結局，但ALT和組織學應答僅作為次要指標[21]。多數學者認為HCV 2型感染者對干擾素治療的反應性比HCV 3型差，治療前HCV RNA含量低時，治療反應率高。相反，治療前HCV RNA含量高時，治療反應率低，停藥半年后HCV RNA仍回升于治療前的水平，提示治療前患者HCV RNA的水平可預測干擾素的治療效果[22]。1型和4型對于聚乙二醇（Peg）干擾素聯合利巴韋林標準化治療較2型和3型更為耐藥。Pegα-2α干擾素是將普通干擾素2α與聚乙二醇共價結合而來，peg是一個大分子的線性聚體，能在干擾素分子表面形成一個分子屏障，使其免受酶的分解，穩定性增加，體內清除率減慢。Pegα-2α干擾素的T1/2為96h，藥物濃度變動小，消除了普通干擾素的“峰谷”效應，對病毒的抑制作用更持久。Pegα-2α干擾素主要分布在血液和肝臟，并且主要在肝臟代謝，從而發揮最大的治療效應[23]。同時由于Peg的分子屏障作用，減少了中和抗體的生成，降低了過敏反應，具有更優越的安全性。兩個大型臨床注冊試驗評估Pegα-2α干擾素聯合利巴韋林治療初治患者總的SVR為60%[24]。以下情況可優先考慮應用聚乙二醇干擾素治療：（1）在既往治療中對普通干擾素無效或治療后復發者；（2）對難治病例（病毒載量＞2×106copies/m l，基因 1 型，年齡＞50歲，男性，代償期肝硬化或者酗酒者）；（3）普通干擾素治療12周HCV RNA載量未下降或下降幅度小于＜2log者。現在利巴韋林被批準用于治療慢性丙型肝炎只能在干擾素聯合治療方案中應用[25]。

療程的判斷應根據患者的不同情況確定。理論上講，對治療有效者，療程越長，持續應答率越高，以HCV基因型和治療中HCV RNA下降速度最為重要。對基因型2、3型患者：（1）在治療4周或12周時血清HCV RNA陰性者，6個月療程可使60%以上患者獲得持續性應答；（2）對治療12周HCV RNA未轉陰但下降幅度＞2log者，為達到持續應答，療程需要延長至12個月；（3）在以往治療中，療程為6個月但復發者，療程應該延長至12個月；（4）病毒載量＞2×106copies/ml，年齡＞50歲，男性，肝硬化（代償期）或者酗酒者，療程也應當延長至12個月。對基因1型的患者，標準療程為聯合治療12個月，如果病毒清除延遲（HCV RNA在12～24周轉為陰性），應考慮將治療時間延長到72周[26]。

基因型的測定有助于決定療程和利巴韋林用量。基因2、3型感染僅需要治療24周，利巴韋林用量為800mg/d即可達到70%～80%的持續病毒學應答。而基因1型感染需要48周療程，利巴韋林用量應達到1000～1200mg/d，即使采用長效干擾素和利巴韋林進行48周的聯合治療，1型HCV感染者的SVR也僅有40%～50%[27]。我國臨床試驗結果表明，PEG-干擾素α-2a24周單藥治療慢性丙型肝炎患者的SVR為41.5%，其中基因1型患者為35.4%，非基因1型患者為66.7%[28]。馬烈等[29]報道基因1型患者復發率為54.5%，非1型患者復發率為32.1%。

資料還表明，12周時的早期病毒學應答（early virus response，EVR），即HCV RNA載量下降2個對數值或在檢測水平100copies/mL，可預測停藥后24周的SVR，具有較好的臨床意義[26]。HCV RNA測定對基因2、3型感染者意義不大，治療結束時HCV RNA陰性提示獲得病毒學應答，應在24周再次檢測以評價其持續應答，而治療結束時HCV RNA仍然陽性則可能出現復發。基因1型感染者接受聚乙二醇干擾素聯合利巴韋林治療時，在治療前和12周時測定HCV RNA可以評價早期病毒學應答，12周時HCV RNA下降2個對數值或者陰性者應繼續治療至48周，如果未獲得早期病毒學應答，即使治療48周，獲得持續性病毒學應答的幾率也很低。

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