間充質干細胞修復心肌的旁分泌效應機制

張潤峰, 高連如 (中國人民解放軍海軍總醫院心臟中心, 北京 100048； 通訊作者,E-mail:lianru@yahoo.com.cn)

1976年 Friedenstein等報道了骨髓中存在克隆性生長的基質細胞,1991年 Cap lan等正式將這類細胞命名為骨髓間充質干細胞(BMSCs)。BMSCs是具有自我更新、分化增殖和多向分化潛能的干細胞。許多研究顯示,骨髓以外的其他器官中也廣泛存在著結締組織干細胞,體內所有這類干細胞統稱為間充質干細胞(MSCs)。因取材方便,自身移植無免疫排斥反應,MSCs被廣泛應用在組織工程、細胞移植、基因治療等臨床方面。目前 MSCs已成為一種理想的治療心肌損傷的移植細胞[1]。

越來越多的研究發現,MSCs具有旁分泌功能[2],其治療缺血性心臟病有賴于其旁分泌作用機制[3]。MSCs的旁分泌機制主要表現為促進新生血管生成、抗心肌細胞凋亡、趨化其他細胞參與心肌修復等 3個方面。本文就 MSCs修復心肌的旁分泌作用機制進行綜述。

1 MSCs分泌多種生物活性因子

最近研究顯示,MSCs至少分泌 34種蛋白質[4]；其中分泌 10種不同的生長因子,10種不同的細胞因子、化學趨化因子及其他的蛋白質。MSCs所分泌的這些蛋白質類物質對組織的修復具有不可估量的作用[5]。

1.1 分泌生長因子及其受體 Kinnaird等研究證實[6],MSCs可表達促血管生成素 1/2(Ang 1/2)、血管內皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PGF)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、血小板源生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子 -β(TGF-β)、胰島素樣生長因子 (IGF-1)、生長激素(GH)和肝細胞生長因子(HGF)等多種生長因子。這些生長因子參與調節細胞凋亡、增殖、營養、支持、存活、遷移、歸巢、分化和表型等多種細胞反應。

MSCs同時還可表達多種生長因子受體,如MSCs表達 VEGF受體 -1(VEGFR-1)；人 MSCs表達的 VEGFR-1介導了該細胞對血管內皮生長因子A(VEGF-A)的反應[2]。

1.2 分泌多種細胞因子和化學趨化因子 人類ESCs可分泌多種細胞因子,如趨化因子(CXCL6)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、化學增活素(GRO-a)、NCC4、胰島素樣生長因子結合蛋白(IFGBP)、IL-1β、白細胞抑制因子、單核細胞化學趨化蛋白 -1(MCP1)、巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)等,其調節功能涉及代謝、防御反應和組織分化[7]。移植大鼠骨髓 MSCs誘導缺血腎臟 IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子下調,而 IL-10、TGF-α明顯上調,從而減輕腎臟損傷[8]。

BMSCs主要高度表達與成骨細胞黏附和血管生成及重塑有關的因子,包括Ⅰ型膠元、纖維粘連蛋白(fibronectin)、層粘蛋白(laminin)和玻連蛋白(vitr onectin)[2]。人類 MSCs表達整合素 α2、α4、α5和 β1等,介導干細胞黏附到內皮細胞,參與細胞保護[9]。

1.3 分泌調節肽 未分化的 MSCs表達腎上腺髓質素(ADM)、降鈣素、降鈣素基因相關肽(CGRP)等的 mRNA；IL-1β和多糖均能誘導脂肪源 MSCs表達降鈣素、CGRP和 ADM[2]。脂肪 MSCs還表達局部腎素 -血管緊張素系統中的腎素、血管緊張素受體、血管緊張素和血管緊張素轉換酶[10]。BMSCs可分泌心鈉素、腦鈉素等細胞活性物質[11]。

1.4 分泌干細胞特異性活性因子 干細胞還產生一些特異性活性因子,不僅調節干細胞自身的存活、遷移、歸巢和增殖等過程,還調節靶組織的功能與修復。這些因子包括干細胞因子(SCF)、干細胞衍生因子(SDF-1)等[2]。

SDF-1是 G蛋白偶聯受體 CXCR4的配體,干細胞不僅分泌SDF-1,還表達CXCR4,SDF-1及其受體 CXCR4通過 SDF/CXCR4信號途徑抑制 MSCs凋亡,并在干細胞動員和歸巢中具有重要作用。大鼠急性心肌梗死后尾靜脈注射過表達 SDF-1的 MSCs后心功能改善的程度明顯高于 MSCs注射組,并增加梗死區心肌細胞存活率和血管密度[12]。徐亞麗等的研究證實,MSCs通過旁分泌機制在心肌缺血區產生豐富的 SDF-1,并借助其強大的動員、趨化、遷移功能,促進 MSCs黏附、歸巢缺血心肌,并在局部促進血管新生,參與受損心肌的修復[13]。

2 M SCs修復心肌的旁分泌作用機制

有研究者將過表達 Akt的 MSCs移植入心肌損傷的大鼠心臟內,結果顯示 MSCs-Akt對受損心肌具有較強的修復作用,且只有少量的 MSCs分化為心肌細胞。由于 Akt可調節多種細胞因子及其分泌,因此他們提出移植入心臟部位的 MSCs的旁分泌作用有可能是 MSCs修復受損心肌的機制[14]。

Gnecchi等[15]的研究發現,Akt-MSCs移植后 72 h內即可觀察到心功能的改善,提示此顯著效果不可能來自于移植細胞的心肌再生作用,而只可能是移植細胞的旁分泌作用。

Dai等[16]報道,MSCs移植入心梗大鼠梗死區后3個月才能檢測到部分肌細胞血管內皮細胞表型,而全部表型的出現則需 6個月時間；但在移植后 4周即可檢測到心功能增強。由此推測,移植的 MSCs通過旁分泌途徑參與了早期心功能的改善。Tang等[17]將 MSCs注射到心梗大鼠的梗死邊緣區,2周后 bFGF、VEGF和 SDF-1表達升高,Bax表達下降,左室收縮性明顯提高,提示 MSCs通過旁分泌作用促進了血管再生并抑制心肌細胞凋亡,從而改善了心功能。

干細胞心臟移植的有益作用是由于旁分泌機制,還是由于其增殖分化產生新的心肌樣細胞所致,一直是干細胞研究爭論的熱點問題。上述研究結果有力地證明了 MSCs旁分泌作用的存在；隨著干細胞旁分泌效應機制的深入研究,人們開始傾向于從干細胞旁分泌作用上解釋其移植效應。MSCs修復心肌的旁分泌效應機制研究進展如下。

2.1 提高梗死心肌 MSCs移植存活率 MSCs是用于治療心肌梗死的供體細胞,但低存活率和移植后低成功生長率始終限制其應用。美國加州大學Pons等[18]研究發現,VEGF可減輕 MSCs應激,增加促 MSCs存活因子以及磷酸化 Akt和 Bcl-xL蛋白表達,促進 MSCs增殖。MSCs與 VEGF一起作用于梗死心臟,可明顯增加 MSCs的移植成功生長率,進而改善心功能。因此,通過促進 MSCs旁分泌 VEGF,即可解決 MSCs移植后低存活率問題。已有學者利用超聲聯合微泡引起的機械效應和空化效應刺激局部內源性 VEGF的分泌；他們采用診斷超聲聯合微泡介導下經靜脈移植 MSCs,通過 Western blot檢測VEGF蛋白定量,證實超聲 +微泡 +MSCs組的VEGF蛋白表達最高,且顯著高于經靜脈移植 MSCs組及對照組,差異有統計學意義[13]。

2.2 激活心肌源干細胞 越來越多證據表明,心肌并非終末化組織,存在心肌源干細胞,可向心肌細胞分化；MSCs等外源性干細胞發揮心肌修復作用有限,最終需依靠心肌源干細胞激活、分化并遷移到心肌梗死區域重建心肌[19]。曹青等研究證實,MSCs旁分泌作用能夠促進心肌源干細胞內心肌鈣蛋白T、縫隙連接蛋白 -43和轉化生長因子 βⅢ型受體的表達,并提高 smad2蛋白磷酸化程度,激活心肌源干細胞向心肌細胞分化[20]。

以往的研究認為,移植的干細胞雖可在梗死心肌存活,但數量少；雖可表達心肌細胞表型標記,但未能證明移植的干細胞可分化為成熟、有完全功能、與本身心肌相連、真正再生的心肌細胞。因此,MSCs通過旁分泌作用激活心肌源干細胞,使之分化為成熟的心肌細胞這一發現,為干細胞研究提供了新的方向,也將為干細胞研究做出重大而實質性的貢獻。

2.3 促進血管新生 移植細胞能分泌促血管生長的細胞因子如 VEGF和 bFGF,促進側支循環建立；刺激宿主心肌組織分泌 VEGF,促進原血管系統再生成。

Fuchs等[21]實驗證實,MSCs在體內外均可增加局部血管內皮生長因子的水平,從而促進局部血管的新生。Tang等[17]將體外培養的 MSCs移植到 SD大鼠冠脈結扎區域內,8周后取材行免疫組化染色計算血管密度,結果顯示 MSCs移植組大鼠急性心肌梗死區的血管密度明顯高于對照組,血管內皮生長因子在移植組的表達顯著高于對照組。

Kennard等[22]利用大鼠的后肢制作缺血模型,然后將自體的 MSCs注射入其缺血部位。發現移植的干細胞分泌的血管生成因子,促進大鼠后肢血管的再生并且改善了血供。

2.4 抗細胞凋亡 Xu等[23]證實,富含 VEGF、bFGF、SDF-1、IGF-1的 BMSCs與心肌細胞共培養減輕缺氧誘導的心肌細胞凋亡。Akt基因修飾的 MSCs可以通過旁分泌的抗凋亡作用保護缺血心肌[15]。Akt-MSCs培養基明顯抑制缺氧誘導的細胞凋亡并觸發體外成年心肌細胞強烈的自主收縮,向缺血心肌注射該培養基后明顯限制心肌梗死范圍、改善心功能,表明 Akt-MSCs介導的心臟保護機制涉及MSCs的抗凋亡機制[24]。

2.5 抑制免疫炎癥反應 MSCs具有獨特的免疫抑制特性,可以抑制淋巴細胞增殖、抗原呈遞細胞的活化與成熟,移植到受體后具有一定程度的免疫抑制和炎癥調節作用。

TGF-β1是已知的具有免疫調節作用的因子。張偉等[25]研究發現,MSCs分泌較高水平的 TGF-β1,抑制 T細胞的活化與擴增,參與多種生物過程,包括維持免疫穩態和誘導自身耐受。

移植 MSCs可下調大鼠梗死心肌促炎細胞因子腫瘤壞死因子 -α和白細胞介素 -6的表達,上調抗炎細胞因子白細胞介素 -10的表達,提示 MSCs可調節心肌梗死后所伴隨的免疫炎癥反應,通過調節心肌梗死后的促炎/抗炎因素的平衡來保護心肌細胞,抑制心室重構[26]。

2.6 保護和恢復細胞外基質的完整性 Sam等[27]證實,MSCs能分泌一些基質成分修復受損傷的宿主細胞外基質,從而恢復宿主心肌細胞的結構性支撐,限制梗死區域的擴大和改善梗死局部的收縮功能。韓瑜等[28]的研究表明,大鼠 BMSCs的缺氧和無血清條件培養液能夠通過旁分泌刺激心臟成纖維細胞自身合成膠原能力的增強,提示移植到缺血心肌缺血區的 BMSCs可能通過旁分泌作用影響心臟成纖維細胞的膠原合成,從而參與心肌的修復。

3 影響 MSCs旁分泌效應的因素

3.1 缺氧 缺氧是誘導干細胞分泌功能的重要刺激因素。人類 MSCs在單純缺氧條件下可分泌多種細胞因子,如 FGF-2、FGF-7、IL-1、IL-6、TGF-b、TNF-α、VEGF等。缺氧激活 MSCs釋放 VEGF是通過STAT3和 p38MAPK途徑介導,STAT3基因敲除小鼠缺氧誘導的 MSCs分泌功能下降[2]。

與常氧相比,缺氧可顯著促進 Akt蛋白表達,提示缺氧雖可致細胞凋亡、增殖滯緩,但仍可促進 Akt較強表達,提示 MSCs在缺氧環境下,可能通過提高Akt的“保護性”機制而參與細胞增殖、減輕細胞凋亡等[29]。

MSCs對單純缺氧損害較耐受,缺氧后促紅細胞生成素信號通路的主要成分均顯著上調,提示促紅細胞生成素信號通路在 MSCs耐缺氧和旁分泌保護能力中起著重要作用[30]。

3.2 機械力的牽拉 機械力的牽拉會引起心肌細胞基因表達,蛋白合成增加,改變心肌細胞內信號轉導；因此,機械牽拉也會在某種程度上對具有成肌分化潛能的 MSCs的基因表達與蛋白合成產生一定影響。

3.3 生長因子和細胞因子 MSCs的分泌功能受生長因子和細胞因子調節。TGF-β下調 MSCs中MCP-5表達,該作用在小鼠股動脈結扎致后肢缺血模型上得到證實。TNF-α刺激小鼠骨髓 MSCs分泌VEGF,并活化 p38-MAPK和 STAT3途徑；p38-MAPK抑制劑明顯抑制野生型小鼠 TNF-α誘導的 VEGF分泌[2]。

4 總結與展望

迄今為止,細胞移植產生臨床效果的機制仍不十分清楚。旁分泌作用在 MSCs移植過程中起著非常重要的作用。MSCs在局部缺氧、缺血微環境中,可能分泌多種生物活性因子,各種因子能夠作用于鄰近的心肌細胞和成纖維細胞,通過復雜的旁分泌途徑調節某些基因的表達,并促進血管再生及側支循環形成,抑制細胞凋亡,對降低了的臟器功能產生一定的代償作用。

MSCs旁分泌功能的揭示,對于人類疾病的治療具有重大而深遠的意義。相信隨著 MSCs的旁分泌功能的深入研究,人類可積極有效地調動干細胞旁分泌這種機體內源性的調節和保護機制,有望實現對 MSCs存活、增殖、分化等的全方位調控；或直接應用干細胞分泌的活性因子替代細胞,治療心肌梗死,從而解決目前干細胞研究中存在的一系列問題:如心臟劇烈的炎癥反應導致干細胞無法存活,移植的干細胞的數量與活性不足,自體細胞來源受限,潛在的不安全性。

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