毛細管電泳吡啶釕電化學發光檢測天仙子中生物堿

1 引 言

天仙子是一種天然中草藥，它的主要活性成分為阿托品和東莨菪堿 。目前，分析天仙子的方法主要有：核磁共振技術、紫外分光光度法、高效液相色譜法和毛細管電泳分離法等。毛細管電泳技術（CE）具有進樣體積小、分離效率高等優勢。吡啶釕（Ru(bpy)2+3）電化學發光法具有激發態壽命長、發光效率高、試劑可循環再生等優點。 CE與Ru(bpy)2+3電化學發光聯用技術（CE-ECL）將二者優勢有機組合，已成為分析化學領域中很好的分析工具。阿托品和東莨菪堿具有叔氨結構，可以增強吡啶釕電化學發光，本研究采用CE-ECL分析技術分析了中藥天仙子中的阿托品和東莨菪堿。

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2 實驗部分

2.1 儀器與試劑 毛細管電泳電化學發光綜合分析儀（西安瑞邁電子科技有限公司）。ECL檢測采用三電極系統：直徑500 μm Pt盤工作電極、Ag/AgCl飽和參比電極、Pt絲對極。石英毛細管（52 cm×25 μm i.d.，河北永年光學纖維廠）。三聯吡啶釕六水合氯化物(美國Aldrich公司）。硫酸阿托品和氫溴酸東莨菪堿（美國Sigma公司）。磷酸鹽、NaOH、氯仿和石油醚均為分析純。二次蒸餾水采用Mili-Q超高純凈水體系（美國Milipore公司）制備，所有溶液均用二次蒸餾水配制。中藥天仙子購于長春市藥材公司。

2.2 實驗方法 毛細管用0.1 mol/L NaOH充滿并浸泡過夜。電泳分離之前，分別用0.1 mol/L NaOH、二次蒸餾水、緩沖液沖洗毛細管各10 min。ECL檢測池中添加5 mmol/L 三聯吡啶釕、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.48），檢測池中溶液3 h后更換一次，以保持實驗重現性。本實驗采用柱端ECL檢測模式，借助光學顯微鏡準直工作電極與毛細管出口端，并固定二者距離為150 μm。綜合考慮進樣量對檢測靈敏度和分離度雙重影響，本實驗電動進樣條件為12 kV×9 s。分離緩沖溶液pH 8.48，檢測電位1.2 V，光電倍增管偏置電壓800 V。

2.3 中藥生物堿的提取 取約0.5 g碾成粉末狀的天仙子準確稱重，加入5 mL石油醚超聲20 min，棄掉石油醚層。加入4 mL氯仿超聲20 min，萃取過程重復2次。提取液合并后揮干，提取物用二次蒸餾水溶解，經0.45 μm醋酸纖維膜過濾，濾液儲存于4 ℃冰箱中備用。

3 結果與討論

3.1 分離緩沖溶液pH值的影響 當緩沖溶液的pH值在4.06~6.08之間，兩峰重疊。隨著pH值增加，東莨菪堿遷移行為發生改變，兩峰部分分離，pH=8.48時分離度最高。繼續增大堿度分離度反而減小，可能是由于二者在偏堿性緩沖液中荷質比類似具有相近的遷移行為所致。

3.２ 檢測池緩沖溶液pH值的影響 生物堿與吡啶釕發生ECL共反應，先氧化成自由基中間體， 然后脫去質子，與三價吡啶釕發生反應，產生激發態Ru(bpy)2+*３，Ru(bpy)2+*３回到基態放出光子。不同胺類最佳ECL反應所需pH值不同。隨著pH值的增大，兩種成分發光強度呈現先增長后下降趨勢，在pH=7.48和pH=6.03時，阿托品和東莨菪堿分別取得最高ECL強度。但是二者分離度隨著pH值增大而增大。本實驗緩沖溶液pH=7.48。電動進樣12 kV×9 s。

3.3 線性范圍、精密度和檢出限 在最優條件下， 阿托品和東莨菪堿分別在0.29～5.8 mg/L和3.0～303 mg/L范圍內，濃度與峰高呈良好線性關系。連續進樣6次測峰高與遷移時間的RSD，阿托品為6.1%和0.68%，東莨菪堿為5.8%和1.6%。阿托品和東莨菪堿的檢出限分為0.014和0.03 mg/L（S/N=3）。

3.4 中藥天仙子的測定 在最佳分析條件下，天仙子提取液適當稀釋進樣，獲得生物堿含量為：阿托品0.035%，東莨菪堿0.051%。阿托品和東莨菪堿的回收率分別為96.21%和97.04%（全文詳見http://www.analchem.cn/fujian/091157.pdf）。