Livin基因與腫瘤的研究進展

西安交通大學醫學院第二附屬醫院呼吸內科(西安 710004)柴春艷 綜述 李雅莉 審校

凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apop tosisp rotein,IAP)是近年來備受矚目的一類蛋白家族,是一類新的獨立于 Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些 IAPs成員異常高表達常引起組織凋亡受阻,與腫瘤的發生發展密切相關。通過 RT-PCR、Northern blot等技術檢測發現 Livin基因在胎兒發育過程中的多種組織中有高表達,在大多數成人組織中(除胎盤外)低表達或不表達,而在多種惡性腫瘤組織或細胞株如黑色素瘤、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、胃癌、非小細胞肺癌和白血病等中均表達增高[1～6]。表明該基因可能在腫瘤的發生和發展中起著重要作用,并有研究認為癌癥患者放化療的耐藥與 Livin基因的表達水平有關。 Cmkovic等[7]研究發現 He-la細胞抵制阿霉素、射線和 TNF誘導的凋亡的機制在于細胞內 Livin基因過表達,用siRN A靶向干擾 Livin的表達后能增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。據此,Livin基因有可能成為腫瘤治療的潛在分子靶點,是目前腫瘤研究的新熱點。

1 Livin基因的結構 Livin(又稱 M L-IAP/KIAP)是于 2000年 Lin等[8]根據 IAPs基因同源序列,在人的胎腎cDN A文庫中發現的新成員,當時將其命名為 KI-AP(Kidney inhibitor of apop tosis protein);同年,Vucic等[1]發現該基因在黑色素瘤細胞中高表達,并稱其為 M L-IAP(Melanomainhibitor of apop tosispotein);2001年 Kasof等[9]將之命名為 Livin并沿用至今。

Lin等[3]用熒光原位雜交方法確定 Livin基因位于人 20號染色體 20q13.3區域,全長 4.6 kb,包含 7個外顯子。此外還發現存在長約 2.2,2.8和 4.0 kb的轉錄子 ,Livin蛋白 N端僅包含一個 BIR結構,包含 4個α螺旋和一個三股抗平行β片層,與相應的氨基酸殘基共同構成疏水核心。C端含有一個RN G環指結構[2,4],氨基酸殘基 C124,C127,H44及 C151與鋅原子結合,借以穩定整個重疊結構。 2001年,Ashhab等[10]研究發現 Livin有兩種異構體,是同一基因轉錄后由于剪切方式的不同而形成的兩種 mRNA亞型,命名為 Livinα和 Livinβ,兩者僅在外顯子 6處有 54個堿基的不同 ,分別編碼 298個氨基酸和 280個氨基酸的蛋白質。兩種異構體蛋白的結構高度相似,均只含有一個 B IR結構域和一個 R ING結構域,在這兩種結構域之間有 18個氨基酸的差別。但在體外實驗顯示兩種異構體具有不同的抗凋亡特性和組織表達:兩者都能抑制由TN F-α誘導的凋亡,但只有 Livinβ能夠阻斷足葉乙甙誘導的凋亡[2];在對多種實體腫瘤 Livin表達的研究中,兩種亞型常同時表達,但僅有 Livinα在淺表膀胱癌的復發早期表達[2];用siRN A技術沉默 Hela細胞中 Livinβ的表達而不是 Livinα才能夠阻抑細胞株的生長[11]。是何原因導致了這樣的差別 ,目前尚無明確結論,初步的設想認為在外顯子 6處 Livin α較 Livinβ多出 54個堿基形成的 18個氨基酸序列可能形成一定的空間結構而造成明顯的功能差異[12]。但具體的機制仍需要進一步深入的研究。

2 Livin基因的作用機制

2.1 Livin與 Caspases蛋白 Livin具有抗凋亡的作用已經在很多實驗觀察和臨床研究中得到證實,但對于 Livin在體內具體的作用機制目前尚未完全闡明。目前的研究認為它可以作為一種酶抑制劑通過 B IR結構域與凋亡過程中激活的核心物質 Caspases蛋白如 Caspase-3、Caspase-7等結合并導致Caspases蛋白的失活和降解。Caspases蛋白是細胞內的天冬酰氨特異酶切的半胱氨酸蛋白酶家族,是介導凋亡的主要因素之一。大多數刺激物都是通過激活 Caspases蛋白的級聯反應而引起凋亡的。在 Fas/caspase-8誘導的死亡受體途徑中,Livin直接抑制該途徑中的核心 Caspases-3蛋白酶的活性;而在另一條細胞色素 C/Apof-1作用的線粒體途徑中,Livin也能與Caspase-9前體蛋白及其激活形式結合或通過阻斷 Caspase-3對 Caspase-9前體蛋白的反饋激活從而產生抗凋亡的作用。但也有學者在對黑色素瘤細胞株的研究中發現了一個令人迷惑且自相矛盾的現象[13],Livin在與 Caspase-3、Caspase-7結合產生抗凋亡作用的同時也能夠被 Caspase-3和 Caspase-7在特異的 Asp-52位置處裂解,而且通過轉染實驗發現 Livin裂解后的亞單位反而獲得了促進凋亡的能力而同時 Caspase-3和Caspase-7的活性也被抑制。這種現象表明 Livin對于 Caspases蛋白有復雜的調節機制,也表明了 Livin結構的完整性是 Livin發揮抗凋亡作用的前提條件。對于該現象最近的研究有了一些新觀點:Nachmias等[14]發現完整的 Livin蛋白在細胞胞漿內彌散地分布,而裂解后截短的 Livin(Truncated Livin,tLivin)定位于細胞核周高爾基體。利用突變分析發現了 tLivin促進凋亡的兩個重要功能區域—裂解后暴露的氨基末端和RN G結構域,前者決定了 tLivin在核周的定位,并且只有在正確定位后,tLivin的 RNG結構域才能發揮它促進凋亡的功能。

2.2 Livin與 TAK1/JN K1途徑 近年的研究發現 JNK1途徑在 IAPs抗凋亡中發揮重要作用,是 Livin對抗 TNF-α和白細胞介素-1β轉化酶(ICE)誘導凋亡的一條重要途徑[15].Livin能夠直接結合轉化因子 β激酶(Transforming growthfactor-β-activated kinase,TAK1)來激活絲裂原激活蛋白 JNK1,T AK1結合蛋白 (TAK1-binding protein,T AB1)是TAK1的共反應子,TAB1本身對 JNK1無激活作用,但 Livin可與 TAB1結合進一步激活 T AK1。

2.3 其他途徑 還有學者認為具有 RNG結構域的IAPs如 Livin等具有泛素連接酶(Ubiquitin Ligase,E3)的功能[16]。泛素能夠與靶蛋白共價結合,導致靶蛋白發生泛素化,然后再被一種蛋白水解復合物降解并失去靶蛋白原有的功能。Livin可以作為一種泛素連接酶 ,使其靶蛋白 Caspases發生泛素化并降解從而抑制細胞凋亡。Livin作為泛素連接酶還可以導致 Smac/D IABLO蛋白的降解[10]。 Smac(Second mitochondria derived activator of caspases)又 稱 作 DIAB-LO,是IAP家族重要的負性調節蛋白,是在凋亡信號的刺激下,由線粒體釋放入胞漿,在胞漿內成熟與 IAPs的 B IR端直接結合而抑制 IAPs的活性。Livin使 Smac蛋白泛素化并降解后可間接阻止 Smac對抗 XIAP的凋亡抑制作用[17]。在對其它 IAP蛋白作用機制的研究發現 IAPs還可以通過 N F2 κB激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶途徑、鈣離子結合蛋白等方式發揮抗凋亡作用。Livin是否也有類似的作用方式還有待研究進一步證實。

3 Livin基因在腫瘤中的表達

3.1 泌尿系統腫瘤 Gazzaniga等[6]的研究發現,RTPCR檢測膀胱癌細胞時 Livin-a在 24例正常膀胱組織中不表達,而在 7例(23%)患者中表達,而 Livin-β沒有檢測到。通過對基因表達和復發時間的分析發現,Livin的表達,Bcl-2/Bax的高比率,bcl-XL的表達對預測復發有統計學意義,尤其Livin-a在膀胱癌的復發早期時表達,提示 Livin在淺表性膀胱癌的演變中起一定作用,并且可以作為腫瘤早期復發的標志。Wagener等[18]應用 RT-PCR、免疫印染、免疫組化等技術對數百例腎細胞癌細胞和正常腎細胞進行研究,發現腎細胞癌細胞和正常腎細胞中均存在 Livin的表達,且亞型相同,但在腎細胞癌細胞中表達顯著增加。劉賢奎等[19]通過對 46例膀胱移形細胞癌患者的研究中也發現,與正常人相比,膀胱移形細胞癌患者的抗 Livin抗體水平增加非常明顯。Livin在膀胱移形細胞癌中的過度表達提示其可作為分子治療膀胱移形細胞癌的一個靶點。Kempkensteffen[20]的研究也表明了這一點,Livin可作為腎細胞癌分子治療的一個靶點,而不是評估預后的一個因素。

3.2 呼吸系統腫瘤 Hariu等[17]研究表明 Livin與肺癌有一定的相關關系,他們應用 RT-PCR方法檢測到 Livin可在許多肺癌細胞株和原發性肺癌組織中呈異常表達,而在正常的肺組織中卻未見表達。Tanabe等[21]也用 RT-PCR檢測 38例非小細胞性肺癌(NSCLC)肺癌組織 Livin的 mRN A表達情況,并與 15例正常肺組織作對照,結果發現肺癌組織 Livin mRNA表達率為 76.3% (29/38);而正常肺組織表達率分別為 6.7%(1/15)。這一研究結果顯示 Livin在 NSCLC發生發展中起著重要作用,并且可通過檢測 Livin的表達情況,有助于肺癌患者的診斷。 Yagihashi等[22]研究還發現:51.3%(19/37)的肺癌患者血清 Livin抗體的檢測為陽性,因此,如能檢測到 Livin抗體同樣將有助于肺癌患者的診斷。

3.3 黑色素瘤 對 Livin在黑色素瘤治療方面的研究也頗為深入,V ucic等[23]發現 Livin的過度表達能夠抑制惡性黑色素細胞發生凋亡,潛在地促進黑色素瘤癌基因的表達。而且高表達 Livin基因的黑色素瘤細胞也可以阻斷抗癌藥所致的細胞凋亡,使其對化療藥物不敏感;因此,檢測患者體內 Livin的表達率,可指示該患者對某化療藥物的敏感性[24]。如果能找到一種藥物可以降低 Livin的表達,就可以抑制這種黑色素瘤細胞的增殖。Puri等[25]研究發現 T-oligos(一種寡肽)就能大大地下調 Livin基因的表達。這為我們治療惡性黑色素細胞瘤提供了一種更好的方法。

3.4 消化系統腫瘤 相關報道表明,Livin在多種消化系統腫瘤中呈現高表達。 Ashhab等用 RT-PCR技術檢測發現Livin-a和 Livin-β在結腸癌細胞系 HT29M TX、HT29中呈高表達。黎軍和等[26]通過對 81例行根治性手術后的 Dukes’B期的結直腸癌組織的研究發現。 Livin在 Dukes’B期結直腸癌組織中的陽性率為 45.7%,明顯高于正常對照組的 8.3%(P＜0.05)。Cox多因素分析顯示 Livin陽性為 Dukes’B期結直腸癌獨立不良預后因素(P=0.047)。 Yagihashi等[27]通過對胃腸腫瘤中的 Livin mRN A研究發現,Livin mRNA可在胰腺癌細胞系AsPC? 1、結腸癌細胞系 HT-29、肝癌細胞系(HepG2)等細胞系中表達,在胰腺癌細胞系 AsPC-1和結腸癌細胞系 HT-29表達較高 ,與 GAPDH mRN A的比值分別為 0.78和 0.42,而在另外 2個胰腺癌細胞系(MIA PaCa-2和 BxPC-3)、胃癌細胞系(M KN-1)和另外 2個結腸癌細胞系(LSll80和 SW620)中未檢測出 Livin mRN A。以上研究表明,檢測 Livin抗原有望成為發現腫瘤的新方法。

4 Livin與腫瘤治療 Crnkovic-Mertens等[7]利用基因轉染和特異性小干擾 RNA(siRNA)技術,在肺癌 SPC-A1細胞株中建立 Livin異構體α和β特異的基因沉默體系,觀察誘導 SPC-A1細胞凋亡效應中的不同作用,并用 TUNEL法和流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果顯示內源性 Livinα和 Livinβ基因沉默后,SPC-A1細胞克隆形成能力較對照組顯著下降,促使 SPC-A1細胞發生凋亡,表明 Livinα和 Livinβ兩種異構體均能作為誘導肺癌細胞凋亡的分子靶點,通過使 Livin基因沉默的靶向誘導肺癌細胞凋亡可作為手術、化療、放療等傳統治療的輔助手段。 Schmollinger等[28]發現 Livin可作為一個抗原靶點來治療黑色素瘤,高滴度 IgG抗體可以識別 Livin并與之結合,使其失去活性,從而達到治療黑色素瘤的目的。

由于 Livin在多種腫瘤中高表達,在一些腫瘤細胞中特異表達,研究 Livin的作用機制可為腫瘤的發生發展、診斷、治療及預后提供重要的理論依據,有望成為腫瘤的標志物,可能成為腫瘤治療的新靶點,為腫瘤的診斷治療開辟一條新途徑。

5 展望 Livin作為 IAPs家族的新成員,具有特異的BIR和 RN G指結構域,可以通過多種途徑發揮其抗細胞凋亡作用。Livin與腫瘤的發生、發展、預后和耐藥密切相關,并為腫瘤的早期診斷、基因治療和細胞治療提供了新的靶點。

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