禽支原體病最新診斷標準

奚德華，羅堅強，王姣

（常州市動物疫病預防控制中心，江蘇常州 213015）

雞毒支原體（MG）和滑液支原體（MS）屬于柔膜體綱，支原體目，支原體科。雖然火雞支原體和衣阿華支原體也可以引起家禽的疾病，但MG和MS是致病支原體中最重要的，并且在全球廣泛傳播。

MG感染在雞和火雞中十分重要，會造成呼吸系統疾病、肉蛋產量減少。它也會造成禽的上呼吸道病。最近在北美發現，MG會引起家雀結膜炎。在家禽中，MG感染可通過種蛋垂直傳播，也可通過密切接觸水平傳播，環境樣品中可鑒定出MG特異性核苷酸。目前尚未證實有其它傳播方式。

MG和MS感染的確診手段主要有：分離培養、血清學方法或從感染組織/棉拭子樣品中檢測DNA。盡管疑似樣品可以接種雞胚或雞，但由于結果不可靠，常需要重復采樣診斷。

一、病原鑒定

（一）臨床鑒別診斷及樣品采集MG感染的臨床癥狀常表現為亞臨床到明顯的呼吸道癥狀，包括鼻炎、結膜炎、咳嗽和噴嚏，有時會出現鼻腔分泌物，音和張口呼吸。嚴重時出現眶下竇腫脹以致眼瞼閉合，一側或兩側鼻竇炎也是特征之一。這一癥狀在火雞和賽禽中尤為突出。在火雞和賽禽中，還伴有泡沫狀眼部分泌物的結膜炎特征（雞偶有出現）。為了去除眼部分泌物，火雞常造成翅羽及傷口污染。除了結膜炎，感染的家雀還會表現出眼部和鼻腔分泌物和眼瞼腫脹的癥狀。雞毒支原體可能與雞和火雞的急性呼吸道病有關，特別是幼禽和火雞更易感。一些病毒如新城疫、傳染性支氣管炎和一些細菌病如大腸桿菌的繼發感染在很大程度上影響了疾病的嚴重性。在火雞中，禽肺病毒與支原體有協同作用，會引起長期的慢性病及種雞和蛋雞的產蛋減少。最初出現的呼吸道病變是粘液性滲出液，隨后出現卡他樣和干酪樣滲出物，這些滲出物可能會在氣囊中形成纖維素樣滲出，形如塊狀。在火雞和賽禽腫脹的眶下竇中包含粘液樣至干酪樣滲出物。

雞MG或MS感染常與其它一些病原，如新城疫的弱毒株和雞傳染性支氣管炎所引起的呼吸系統疾病混淆。這些病原常與MG或MS混合感染，而禽副嗜血桿菌和多殺巴氏桿菌則不能。在火雞中，MG感染常與禽肺病毒感染混淆，而出現氣囊炎這一典型癥狀亦并非MG感染特有，在大腸桿菌、多殺巴氏桿菌、衣原體或MS也能發生這樣的病變。MS能引發的傳染性滑液囊炎，在鑒別診斷時，要與金黃色葡萄球菌感染和呼腸孤病毒引起的感染性腱鞘炎相區別。

感染滑液囊支原體的雞常表現雞冠蒼白，跛行和生長緩慢，關節腫脹，常見含大量尿酸鹽的綠色糞便。關節和腱鞘處可見粘稠的乳白至灰色滲出物，肝脾腫大，腎腫大，有花斑。呼吸道癥狀和病變與MG類似，只是MS表現輕微些。和MG一樣，MS也與其它呼吸道致病因子有協同作用。MS不同毒株之間在毒力和組織嗜性上差異極大。

從活鳥、活禽或新鮮凍存的禽肉產品。對于活禽，采集鼻腔、口咽、食道、氣管、眼、泄殖腔棉拭子樣品；對于死禽，則采集鼻腔、眶下竇、氣管或氣囊等部位樣品，分泌物可由眶下竇和關節腔中吸取。臨床樣品可通過從死胚或破殼但未孵化成功的雛雞體內采集，可從胚胎的卵黃膜內表面、口咽和氣囊獲得。

（二）病原分離和培養在采集后，所有待檢樣品需盡快進行檢測。在運輸過程中，最佳方式是將小片組織置于支原體肉湯中，而棉拭子則在1～2 ml支原體肉湯中劇烈振蕩后棄去。可以將棉拭子浸泡于支原體肉湯中，隨后再用于樣品采集。在運輸過程中，需加冰袋或者其它制冷措施保持低溫狀態，因為MG和MS在室溫下很快就會死亡。在支原體肉湯中，樣品需要進行倍比稀釋，因為組織中常存在特異的抗體、抗生素或抑制因子，可能抑制支原體增殖。

目前已有幾種用于分離培養的培養基，可通過Mycoplasma Experience、Reigate、Surrey 或United Kingdom購買。支原體培養基通常含有蛋白質消化液和肉浸液基礎，需要添加血清或血清組分、酵母提取液、葡萄糖和細菌抑制劑。非常重要的一點是：每一批新的培養基都需要通過最近分離的體外低傳代MG分離株進行測試，因為一些組分，特別是酵母提取液和血清批次差異很大。

（三）生物學鑒定生化反應（如發酵葡萄糖、不水解精氨酸）可以幫助鑒定，但這不是MG或MS特有的，也不是克隆純化所必需的。

免疫學和DNA檢測方法可以用來鑒定支原體分離株，包括間接熒光抗體技術（IFA）和免疫過氧化物酶檢測法（IP），這兩種方法簡易、敏感度高且特異性強。檢測方法還包括生長抑制檢測（GI）和代謝抑制檢測（MI）。純化（克隆）培養物對GI和MI檢測技術而言是必須的，但對IFA和IP檢測則不是。IFA和IP可以檢測不止一種支原體的存在，而只有特異性血清才會與相應的純化克隆起反應，而其它則不反應。然而，在鴨、鵝和一些野生鳥類體內常會分離到模仿支原體，與MG有相同的生化特征，與MG有血清學交叉反應。該支原體可按Kempf等建立的PCR-RFLP（多聚酶鏈式反應/限制性內切酶片段長度多態性）診斷法，將其與MG相區分。抑或者用MG和模仿支原體的單菌落做平行試驗，對連續稀釋的抗血清做免疫熒光檢測，這要求抗血清要有較高的滴定才行。

上述方法并不能確診，還需接種雞胚或動物接種法進行細致鑒定，但這耗時耗力，因而現在逐漸被PCR技術所取代。就像在人工培養基中一樣，支原體也可在雞胚中增殖，具體做法是：將它們接種于不含醋酸亞鉈的肉湯中，37℃培養30～60 min，然后取0.05～0.1 ml量接種6～8日齡無支原體感染雞胚的卵黃囊，每天照胚，若雞胚在24 h內死亡則棄去，超過24 h死亡的雞胚都冷凍至培養結束，超過5 d仍未死亡的雞胚可以放于4℃冰箱4 h使其死亡以減少收胚時的出血。收集卵黃液在肉湯或固體培養基中傳代培養。卵黃液形成的菌落可能并不清晰，因此需要劃線使卵黃變薄或初次在接種支原體肉湯培養時將卵黃稀釋，以獲得更好的效果。

動物接種法是將可疑組織的勻漿液接種4只8～16周齡對支原體易感的無支原體感染的SPF雞。如果這些雞體內存在支原體，能證實其DNA或/和存在特異性抗體，才能確診。

二、免疫學方法

免疫熒光和IP法對實驗室分離株是普遍適用的診斷方法，而不直接適用于感染滲出液和感染組織，這是因為支原體體積太小，在光學顯微鏡下無法鑒別，而且相應的陽性和陰性對照滲出液/組織不容易獲得。

（一）間接熒光抗體試驗(IFA)IFA試驗的推薦方法。這一方法適用于鑒定在瓊脂板上長出明顯菌落的支原體，步驟簡述如下：①從長有菌落的瓊脂板上，切下1.0 cm×0.5 cm大小的一塊，菌落向上放置在標記過的載玻片上；②為了避免以后弄錯方向，在樣品塊的右下角切下一塊作為標記。在一個載玻片上放置一塊未知的分離株、一塊MG培養物、一塊MS培養物以及另外一個不同種的已知支原體培養物。另一個載玻片上放置一塊未知的分離株；③在第一個載玻片上的每個樣品塊表面滴加一滴適當稀釋度的MG（或MS）抗血清，在第二個載玻片上的樣品塊上滴加正常兔血清；④所有樣品塊放在濕盒中室溫孵育30 min；⑤將每一個樣品塊分別放入一個標記好的含有PBS（pH7.2）的指形管中，在渦旋振蕩器上洗洗2次，每次10 min，最后再把樣品塊放回相應的載玻片上；⑥吸去載玻片上樣品塊的多余水分，在每個樣品塊上滴加一滴適當稀釋的FITC標記二抗，同前孵育及洗滌；⑦將樣品塊放回相應原來的載玻片上，然后用熒光顯微鏡檢測菌落熒光。這個結果的判定是主觀的，需要一定的專業知識。與對照進行比對是必需的，并且這些對照必須是預期的反應。一些實驗室也使用直接熒光法（DFA）進行檢測，即利用熒光素標記抗血清。在DFA試驗中使用比較廣泛的一種技術是，在支原體瓊脂平板上放置一個不銹鋼圓筒，里面不間斷的提供試劑。雖然操作快速簡單，但是所獲得結果的特異性比間接方法要低，因此還是首選間接熒光法。

（二）間接免疫過氧化物酶檢測法(IP)此方法的原理與IFA試驗相似，只是特異性抗體與菌落的原位結合通過添加過氧化物酶標記的抗兔免疫球蛋白來檢測。陽性對照為相應的底物，氧化后可以產生有色菌落。

這樣的免疫結合過程也可以先將菌落印跡在NC膜上，然后用類似的方法進行反應。和IFA試驗一樣，IP試驗可使用多抗血清來進行分離株的血清分型。IP試驗超越免疫熒光方法的優點在于IP試驗不需要昂貴的熒光顯微鏡。

（三）生長抑制試驗(GI)在GI試驗中，支原體的生長被特異性抗血清所抑制，從而可以進行種類鑒定。相對來說，此方法不太敏感，所用血清必須高效價、單一特異性，并且在哺乳動物宿主體內制備，因為禽類血清常常不能有效抑制支原體的生長。試驗中的支原體必須是純培養物，并且應當檢測數個稀釋度，以104CFU/ml的濃度最合適。支原體的生長率會嚴重影響實驗結果，先27℃培養24 h，然后再在37℃培養，則會使生長受到阻礙。

三、核酸檢測法

常規培養和檢測的另一種方法是使用特異DNA檢測法。MG或MS可以用DNA雜交探針來檢測，但是現在更常用的是用PCR來擴增檢測材料中一段特殊的DNA片段。目前至少有一種商品化的MG DNA試劑盒，可以用棉拭子提取物直接進行PCR鑒定。分子生物學方法也可有效用于區別MG和MS株，但是迄今為止，這些方法只能在專門的實驗室進行。一種快速精確的方法是：DNA指紋印跡圖譜技術，即利用隨機引物PCR或隨機擴增多態性DNA（RAPD），該方法可復制性好，使用的PCR引物是隨機的，且長度較短，快速易行，被證實對MG流行病學調查十分有效。但是，該方法要求不同菌株必須在同一塊凝膠中進行跑膠。而且，看似相同的條帶模式解釋也是非常困難的。

四、血清學檢測

血清學檢測通常缺乏特異性和/或敏感性，最好用來檢測群體感染，而不是檢測個體。要用這些試驗進行診斷時，須建立這些檢測的敏感性和特異性。但值得注意的是，這些血清學試驗對老齡禽類和獵禽無效。

最常用的方法是快速血清凝集試驗(RSA)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和血凝抑制試驗(HI)，還有其它的方法，如放射免疫測定法、微量免疫熒光法和IP測定法等。一個群體的血清測試范圍取決于檢測限和可信度。國際行業對該檢測的最低要求和測試范圍有規定，如European Communities Council Directive 90/539/EEC和 美 國NPIP成員國。

家禽公司常用ELISA技術來大規模監測病毒的抗體滴度，這種方法對于支原體檢測也同樣很適用。在此不具體描述ELISA技術的細節，因為很多MG試劑盒已經商業化，相反，HI試驗還沒有商業化的試劑盒，所以下面會提到HI試驗的細節。

（一）快速血清凝集試驗血清采集自某個雞群，在72 h內，如果不是立即檢測，貯存于4℃保存，請勿冷凍。檢測應在室溫（20℃～25℃）下進行，試劑也放在室溫下即可。在檢測之前離心血清，可以減少非特異性。RSA抗原已經商品化，但不同的生產廠商和批次，其特異性和敏感性也會不同。購買的抗原必須按生產廠商的使用說明書保存。合適的RSA染色抗原也可自制，如用結晶紫染色。

在美國，MG和MS陽性參考血清可以從USDA國家獸醫服務實驗室（NVSL）獲得，歐洲可以從法國的AFSSA Ploufragan獲得。不同滴度的雞和火雞的MG、MS和對照血清都能買到。成套的抗血清也可以在Georgia大學禽病室購買到。

國際上還沒有標準來判定該試驗結果，但一個群體的血清陽性率高（10%或更高）則表明有MG感染，尤其經HI試驗或ELISA驗證的。對于進一步驗證，該群體需要在一個月內反復測試。不確定的結果需要分離培養或鑒定其DNA的存在。MG的疑似結果可以用MS抗原交叉檢測（反之MS亦然），因為這些病原有時會交叉感染。卵黃和血清一樣，也可以做此檢測，但卵黃必須先稀釋或提取出來。

（二）血凝抑制試驗MG和MS可以凝集禽紅細胞（RBCs），血清中的特異性抗體可以引起抑制。需要挑選長得好且確定有血凝抑制的菌株。HI試驗需要血細胞凝集性良好的MG和MS抗原、洗過的新鮮的雞或火雞RBCs、合適的待檢血清。抗原可以是在新鮮肉湯培養基上的或是PBS濃縮洗過的支原體細胞混懸液。要長期保持高滴度的肉湯培養抗原是很困難的。尤其是使用濃縮抗原（通常含有25%～50%甘油，凍存在-70℃）會增加非特異性反應的可能性。在美國，MG和MS血凝試驗（HA）抗原可從NVSL購買。

HI試驗可以按已知步驟進行。抗原的HA滴度由倍比稀釋檢測獲得。完整的HA試驗體系可以確定最小抗原量的HA單位。HI試驗是用HA的4單位抗原進行或用有同樣敏感度的已知陽性血清檢測法。

非特異性HA血清必須去除所有非特異性血細胞凝集，所以沒有HA抗原的對照孔會出現清晰的沉淀。用1 ml血清稀釋液加6～8滴雞或火雞的RBCs，37℃培養10 min后取出細胞，上清檢測血細胞凝集活性。

對于判斷陽性和陰性結果國際上還沒有官方的標準，但美國的NPIP認為，1/80或者更高滴度的為陰性，1/40滴度的就十分可疑了。

（三）酶聯免疫吸附法一些MG和MS抗體ELISA試劑盒已經商品化。其靈敏度會因為不同生產廠商陽性和可疑反應的終止水平而不同，有時則刻意降低敏感度來避免MG和MS之間的已知交叉反應。ELISA用MAb來識別位于MG 56kDa上的抗原表位。在這種試劑盒中，和常用的間接ELISA一樣，ELISA板用全菌包被，以結合MAb加入時封閉程度來評價的。MS的ELISA試劑盒是類似的。這種試劑盒的優勢是可以適用于所有禽類血清。

雞毒支原體和滑液支原體抗原的質量要求：

（1）雞毒支原體抗原。抗原通常 由MG的S6株 和A5969株制備獲得，其他菌株也可以用于制備抗原。

用于RSA的MG抗原：下述質量控制只針對用適宜染料染色并含保存劑的MG株混懸液。這種抗原已經商品化。鏡檢下，抗原應該是均勻的混懸液，沒有絮狀物或沉淀，也沒有殘留的染色劑，還要避免細菌和真菌的污染。PH須在6.5～7.5±3℃保存，使用前要預熱至室溫。抗原的敏感性和特異性取決于它與已知不同滴度的陽性血清和已知陰性血清的反應性。陽性反應會出現有色的絮狀物，培養液澄清。以上描述的判定標準在生產廠商標注的有效期內都適用。用于HI試驗的MG抗原：試驗最好使用生長旺盛期的活菌進行。抗原必須避免細菌和真菌的污染。用于ELISA的MG抗原：如果沒有先前的大量試驗和對敏感性和特異性的確定，要制備用于間接ELISA的令人滿意的抗原是十分困難的。大多數實驗室診斷最好的方法是使用可靠的商品化試劑盒。一些試劑盒是USDA認證的，可以在美國的NPIP中使用。

（2）滑液囊支原體抗原。抗原通常由WVU1853毒株制備，其它菌株也可以使用。用于RSA的滑液囊支原體抗原：其規則和制備用于RSA的MG抗原相似。用于HI試驗的滑液囊支原體抗原：其規則和制備用于HI試驗的MG抗原相似。

（3）附加注釋。RSA中非特異性反應的血清不一定在用HA抗原的HI試驗中呈陽性反應。初次感染后2～3周（HI抗體產生所需時間）的血清進行HI試驗可確證RSA陽性反應。但HI試驗具有菌株特異性，因此敏感性不強。ELISA是另一種有效的選擇。血清樣品在RSA試驗前無需冷凍，要避免溶血和污染而導致的非特異性反應。其它疾病滅活疫苗的使用亦會導致非特異性反應。樣品檢測越早進行越好（72 h之內），因為支原體抗體在保存過程中會變質。血清需在56℃水浴30 min滅活。

（略）