優勢菌的篩選及其生理生化特性的檢測

宋波

(西華師范大學生命科學學院,四川南充637002)

1 引言

畜禽養殖環境污染深化是嚴重的社會問題并逐漸受到人們的廣泛關注,我國集約化畜禽養殖業起步比較晚,但發展十分迅猛,養殖業一方面給廣大農戶帶來豐厚的收入,但另一方面畜禽養殖場排放的大量而集中的糞尿和廢水已成為許多城市和農村的新污染源[1]。禽畜糞便已成為固體有機廢棄物的主要來源。不論是規?；酿B雞場還是散養的農戶,隨著規模的不斷擴大,雞糞的污染成了養雞業和農戶最關心的問題。雖然目前在盡力減少對環境造成的污染,但是在實際生產中不少養殖單位和農戶在雞糞綜合利用上依然不盡人意,因此雞糞的處理和利用顯得尤為重要。國內外的研究表明[2],雞糞中含有豐富的營養物質[3]。向雞糞中添加特定的微生物菌群,能有效地促進有機物降解,加速雞糞腐熟進程,同時還有利于消除致臭物質,減輕對環境的污染[4]。本實驗從發酵雞糞中分離5株優勢菌群,并對其生理生化特性進行檢測,旨在為雞糞資源的合理利用,生產高質量的有機肥料奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

供試材料中的新鮮雞糞取自南充某養殖場。分離用培養基包括牛肉膏蛋白胨培養基(分離細菌);20%雞糞抽提液加1.5%瓊脂(分離放線菌);PDA培養基(分離真菌)。搖瓶發酵培養基為20%的雞糞抽提液。

2.2 試驗方法

2.2.1 菌株的分離純化

將新鮮雞糞用無菌水稀釋成濃度為10-2的溶液,采用平板稀釋法將雞糞涂抹在不同類型的固體分離平板培養基上,置于30℃恒溫培養箱內培養。3d后挑取分離平板上的單菌落,并進一步采用平板稀釋分離法純化,然后將特征不同的菌落分別接種于相應的斜面培養基上培養,并保存備用。

2.2.2 菌種的篩選

將所有分離得到的菌株,以10%接種量接種到雞糞抽提液液體搖瓶發酵培養基中(裝量100m L/500m L)100RPM培養。3d后接種劃線到相應的平板上,培養2d后,挑取單菌落保存。

2.3 篩選菌株的生理生化鑒定

2.3.1 淀粉水解實驗

將保存菌種逐個點種在淀粉水解培養基上,30℃培養 3d,滴入少量Lugol's碘液于平皿中,輕輕旋轉平板,使碘液均勻鋪滿整個平板。最后記錄實驗結果。若菌落周圍出現無色透明圈,說明淀粉被水解,透明圈的大小反映水解淀粉的能力。菌株水解能力以公式UP=(D/d)2計算。式中D為透明圈直徑(mm),d為菌落直徑。

2.3.2 酪素水解實驗

分別挑取少許菌種,先接種含酪蛋白的斜面培養基,再點接于酪蛋白的平板,30～32℃培養24～48h,測定平板上菌苔直徑和水解圈的直徑[5]。

2.3.3 油脂水解實驗

將溶化的固體油脂培養基冷卻至50℃左右時,充分搖蕩使油脂分布均勻。無菌操作倒入平板,待凝。用記號筆在平板底部標上菌名。然后將菌種用無菌操作劃成“十字”接種于平板的相對應部分的中心。然后將平板倒置,于37℃溫箱中培養48h后,取出平板,觀察并記錄菌苔顏色,如出現紅色斑點,為脂肪水解陽性,記為“+”,否則為陰性,記為“-”。

2.3.4 產硫化氫實驗

用接種針將菌種接種于醋酸鉛培養基中,置37℃培養48h。觀察并記錄顏色變化,出現黑色者為釋放硫化氫,深淺反映釋放的量[6]。

2.3.5 過氧化氫酶實驗

將菌種接種于相應的斜面培養基上,30℃培養24h。然后滴入3%H2O2數滴于斜面菌體上,若有氣泡為陽性。

2.3.6 有機酸實驗

將菌株分別接種到兩支葡萄糖蛋白胨培養基中,培養2d后,將1支葡萄糖蛋白胨水培養基內加入甲基紅試劑2滴,培養基變為紅色者為陽性,變黃色者為陰性,甲基紅試劑不宜加得太多,以免出現假陽性[7]。

2.4 篩選菌株的形態鑒定

對篩選菌株的形態進行鏡檢及染色分析,具體項目有革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色等。

2.5 菌株雞糞定殖試驗

將適量發酵液與500g滅菌雞糞攪拌均勻,菌數控制在104個/g左右,控制水分在50%左右。裝入內徑為8cm,深為12cm的滅菌陶土盆(底部通氣孔),上面罩以薄塑料(防止水分散發過快)。50℃恒溫發酵,間隔2d取樣,用稀釋平板法測定活菌數。

3 結語

通過本次實驗從雞糞中篩選出5株菌株分別命名A 1～A 5,經過鏡檢其中A 3為細菌,其余4株為酵母菌。

3.1 淀粉水解實驗

5株菌株中有3株能分解淀粉,其中A 4菌株分解淀粉的能力最強UP值達到28,A 1和A 5菌株不具有分解淀粉的能力,見圖1。

圖1 不同菌株水解淀粉能力的 Up值比較

3.2 酪素水解實驗

由圖2可知,A 3菌株和A 5菌株不具有分解酪素蛋白的能力,而其余3株均有降解酪素的能力,其分解能力的大小依次為A 4＞A 2＞A 1。

圖2 不同菌株水解酪素能力的 Up值比較

3.3 油脂水解實驗

5株菌株中只有A 5菌株具有降解油脂的能力,占分離菌株的20%。

3.4 產硫化氫實驗

所分離的5株菌株,都能不同程度產生硫化氫。根據產生硫化氫的深淺判斷產生硫化氫的能力為：A 3＞A 1＞A 5＞A 2＞A 4。

3.5 過氧化氫酶實驗

分離的5株菌株中,有2株微生物能分解過氧化氫,分別是A 2和A 3.占分離菌株的40%。

3.6 有機酸實驗

在分離的5株菌株中,A3菌株具有加入甲基紅以后培養基變紅,呈陽性,說明其具有產有機酸的能力。

菌株在雞糞中的定殖試驗結果5個菌株在雞糞中的定殖試驗結果見表1。各菌株在接種第4d至第6d菌數增加最快,這與雞糞堆肥從第4d進入高溫期第7d降溫相一致。在這期間雞糞化學成分發生很大變化,是有機物降解、除臭和脫水的關鍵時期。其中菌株A 1、A 2、A 4菌數增長較快。

表1 菌株在雞糞中的定殖試驗結果

4 結語

本試驗從自然雞糞堆肥中分離篩選出5株優勢菌,分別對5株菌進行淀粉水解實驗、酪素蛋白水解實驗、定植實驗等其中A 4株細菌具有較強的分解蛋白能力,并且能在雞糞中很好地定殖,是比較理想的雞糞發酵菌株。在進一步的實驗中,可以將該菌株進行發酵雞糞實驗,以便對雞糞的加工處理做出更加合理高效的改進。

[1]張 敏,鄧 宇,張 輝,等.雞糞水厭氧處理實驗研究[J],中國沼氣,2005,23(1)：21～ 24.

[2]石星群,殷培杰,何隨成,等.發酵雞糞的高溫蛋白分解菌的篩選[J].土壤通報,2005,36(6)：946～ 949.

[3]陳昭輝,付 淵,孟慶翔,等.雞糞發酵優勢菌的篩選及其發酵效果的研究[J].中國家禽,2006,28(20)：9～12.

[4]程輝彩,王增利,張麗萍,等.微生物菌劑在雞糞發酵中的作用[J].今日畜牧獸醫,2008(4)：11～ 13.

[5]趙晨曦,蘭時樂,禹逸君,等.雞糞除臭微生物菌群的篩選和應用[J].湖南農業科學,2005(1)：68～ 70.

[6]殷培杰,孫軍德,石星群,等.微生物菌劑在雞糞有機肥料堆制發酵中的作用[J].微生物學雜志,2004,24(6)：43～46.

[8]王立群,彭科峰,張傳富,等.雞糞好氧堆肥中溫期效應細菌及放線菌的篩選及屬別鑒定[J].東北農業大學學報,2007,38(6)：775～779.