車前子不同炮制品多糖含量測定

，，，

(1.溫州市第三人民醫院，浙江 溫州 325000；2.溫州醫學院 仁濟學院，浙江 溫州 325035)

《中國藥典》[1]記載，車前子為車前科植物車前PlantagoasiaticaL.或平車前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟種子， 具有清熱利尿、滲濕通淋、明目、祛痰的功能，用于治療水腫脹滿、熱淋澀痛、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽。在臨床上可治各種病癥[2]。目前，國內外對車前子多糖的研究表明,車前子多糖具有抗炎、緩泄、抗衰老、抗氧化、清除自由基、保護動脈內皮、整腸通便、降低血脂、調節血糖的作用[3-11]。車前子多糖的主要組成單糖是木糖和阿拉伯糖等戊糖[12],殷軍藝等[13]對大粒車前子多糖分離、純化及單糖組成分析的研究中，經GC-MS分析確定PLP由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖構成，其摩爾比為5.6∶9.4∶1.3∶1，但文獻報道中車前子多糖測定通常都是以己糖(如葡萄糖)作為標準對照品。所以本實驗采用周超等[14]在研究中建立的一種準確測定車前子多糖的方法，即采用苯酚-硫酸法測定車前子中多糖量，以木糖作為標準對照物，檢測波長480 nm，希望更準確地測定車前子中多糖的含量。為在選用車前子的不同炮制品時，提供量的參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料 751-GW分光光度計(惠普上海分析儀器有限公司),80-2離心機(上海手術器械廠)，隔膜真空泵(天津市津藤實驗設備有限公司)，單相電容運轉電動機(上海申生科技有限公司)，美的多功能電磁爐(廣東美的生活電器制造有限公司)，萬用電熱器(浙江嘉興市風橋電熱器廠制造)，分析天平，冰箱，透析袋，回流裝置，容量瓶(25、100 mL)，移液管(0.5、1、5 mL)，離心管，燒杯，玻璃棒；D-木糖，80%，95%乙醇，無水乙醇，丙酮，乙醚，氯仿-正丁醇(4∶1)，3%苯酚，濃硫酸，蒸餾水，自來水；車前子，自然曬干。

1.2 實驗方法

1.2.1 車前子的炮制 歷史沿革：宋代有酒浸(《總錄》)、微炒(《局方》)、焙(《寶產》)、酒蒸(《濟生方》)等炮制方法。明代還有米泔水浸蒸(《醒齋》)的方法。清代又增加了青鹽水(《幼幼集成》)。并有“酒蒸搗碎，入滋補藥；炒研，入利水泄瀉藥”(《備要》)的記載。現在主要的炮制方法有炒黃、鹽炙等。生品車前子：取車前子，除雜質，篩去灰屑。清炒車前子：取凈車前子，置炒制容器內，用文火加熱，炒至略有爆聲，并有香氣逸出時，取出晾涼。鹽炙車前子：取凈車前子，置炒制容器內，用文火加熱，炒至略有爆鳴聲時，噴淋鹽水，炒干，取出晾涼。

1.2.2 車前子多糖的提取與精制 稱取干燥的生品車前子50 g,加8倍量體積分數80%乙醇浸泡24 h，過濾，揮干乙醇，加水于沸水浴中回流提取3 h,紗布兩層過濾，濾渣再回流提取2 h，合并濾液，濃縮，加95%乙醇至醇濃度達到80%，冰箱中冷藏過夜。次日離心分離(4 000 r/min，10 min)，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌兩次，干燥得生品車前子粗多糖，稱量。做2分，其中1分精制，備用。生品車前子粗多糖用蒸餾水溶解，Seva ge法除蛋白[15]，然后用流動自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，透析液濃縮,加95%乙醇至醇濃度達到80%，冰箱中冷藏過夜。次日離心分離(4 000 r/min，10 min)，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次，干燥得生品車前子精多糖，稱量。

1.2.3 標準曲線的繪制 準確稱取干燥至恒量的D-木糖標準品25.10 mg,置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水配成0.251 0 mg/mL的溶液。準確移取此溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配成系列標準溶液，濃度為0.005，0.010，0.015，0.020，0.025，0.030，0.035 mg/mL。最佳顯色條件：在上述配制的系列溶液中分別取2.0 mL，加3%苯酚0.5 mL，搖勻后加濃硫酸4.0 mL,充分混合均勻，25℃室溫放置35 min，在480 nm處測量吸光度。

1.2.4 換算因子的測定 精密稱取生品車前子的精制多糖0.030 0 g，配制成0.03 mg/mL，按照1.2.3確定的最佳顯色條件,由回歸方程求出生品車前子精制多糖液中木糖的濃度。按下式計算換算因子f=m/(C·D)。式中:m-稱取精制多糖的質量(mg)，C-精制車前子多糖中木糖的質量濃度(mg/mL)，D-多糖的稀釋因素(mL)。

1.2.5 樣品中車前子多糖的測定 精密稱取生品車前子粗多糖0.030 0 g，配制成0.03 mg/mL,按照1.2.3確定的最佳顯色條件，由回歸方程求出生品車前子精制多糖液中木糖的濃度。按下式計算樣品中多糖的量:W/%=C·D·f/m×100。式中:C-供試液中木糖的濃度(mg/mL)，D-多糖的稀釋因素，f-換算因子，m-供試車前子多糖的質量(mg)。清炒和鹽炙的車前子粗多糖都作同等條件的處理，分別得出相應的多糖含量。

2 結果

2.1 標準曲線 在確定的最佳顯色條件下測定吸光度，以吸光度(A)對木糖濃度(C)作回歸處理，得回歸方程：C=0.030 3 A-0.000 7，R=0.999 6。木糖標準品在0～0.035 mg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.2 換算因子 經過對精制車前子多糖吸光度的測定，并計算后，求得車前子多糖相對于D-木糖的換算因子：f=1.571。

2.3 多糖含量 經過對粗品車前子不同炮制品的吸光度測定，由回歸方程求出相應的車前子精制多糖液中木糖的濃度，并通過計算，得出結果。如表1。

表1 車前子不同炮制品多糖含量測定結果

2.4 精密度試驗 準確移取0.03 mg/mL粗多糖樣品溶液2 mL，按照1.2.3確定的最佳顯色條件，平行測定5份。相對標準偏差RSD=0.98%。

2.5 穩定性試驗 準確移取0.03 mg/mL粗多糖樣品溶液2 mL，按照1.2.3確定的最佳顯色條件，間隔15 min讀取顯色后的樣品溶液吸光度，連續1 h考察其穩定性。相對標準偏差RSD=0.44%。

2.6 加標回收率 準確移取0.03 mg/mL粗多糖樣品溶液2 mL,加入不同濃度的木糖標準溶液各1 mL，按照1.2.3確定的最佳顯色條件，計算回收率(平行測定2次)。結果見表2。

表2 加標回收率測定結果

3 討論

本次實驗測定車前子多糖含量采用苯酚-硫酸法，檢測波長為480 nm，由于車前子多糖的主要組成單糖是木糖和阿拉伯糖等戊糖[12],所以本實驗以D-木糖作為標準對照品，這與以往文獻報道中車前子多糖測定通常都是以己糖(如葡萄糖)作為標準對照品所不同,利用D-木糖與精制多糖的換算因子計算多糖量，得出的結果更能準確地反映其真實值。

通過對車前子不同炮制品多糖含量的測定，不難發現炮制后的車前子多糖含量較生品均降低，王東等[16]對車前子及其炮制品中多糖含量的分析研究結果中表明,3種車前子炮制品，無論是清炒還是鹽炙，其多糖含量較生品都有所降低，與本實驗結果相符。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出社,2005:46.

[2]蔣琴芳.車前子臨床應用偶拾[J].吉林中醫藥,2005,25(10):51-52.

[3]謝小梅,付志紅.車前子多糖對小鼠陰道菌群失調的調整作用[J].遼寧中醫藥,2006,33(2):241-242.

[4]吳光杰,田穎剛,謝明勇,等.車前子多糖對便秘模型小鼠通便作用的研究[J].食品科學,2007,28(10):514-516.

[5]王東,袁昌魯,林力,等.車前子多糖對小腸運動障礙小鼠的影響[J].中華中醫藥學刊,2008,26(6):1188-1189.

[6]李紅,張美玲,張兆芳,等.車前子粗多糖膠囊治療功能性便秘45例療效觀察[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14(9):74-75.

[7]唐永富,黃丹菲,殷軍藝,等,車前子多糖對骨髓來源樹突狀細胞表型和吞噬功能的影響[J].食品科學,2007,28(10):517-520.

[8]袁從英,熊晨,郭會彩,等.車前子多糖抗脂質過氧化作用的研究[J].中國老年學雜志,2009,29:1202.

[9]王素敏,黎燕峰,代洪燕,等.車前子調整脂代謝及其抗氧化作用[J].中國臨床康復,2005,9(31):248-250.

[10]Tomoda M,Yokoi M,Ishikawa K.Isolation and characterization of a mucous polysaccharide, "Plantago2mucilage A"from the seeds of plantago major var.asiatica.Chem Phar Bull,1981,29(10):2877-2884.

[11]付志紅,謝明勇,聶少平.微波技術用于車前子多糖的提取[J].食品科學,2005,26(3):151.

[12]Fischer MH,Yu N,Gray GR et al.Carbohy drate Research,2004,339:2009.

[13]殷軍藝,聶少平.大粒車前子多糖分離、純化及單糖組成分析[J].食品科學,2008,28(9):29-5325.

[14]周超,謝明勇,萬茵,等.車前子多糖的測定方法研究[J].分析實驗室,2008,27(4):58.

[15]陳偉,林新華,黃麗英,等.蘆薈多糖中游離蛋白去除的分光光度法[J].光譜實驗室,2005,22(1):114.

[16]王東,林力,袁昌魯,等.車前子及其炮制品中多糖含量的分析[J].時珍國醫國藥,2002,13(4):198.