排毒雙調綜合療法對腎切除 CRF大鼠血漿 AngⅡ和 ALD影響的實驗研究

董正華 張 楠 李小會 趙天才 曾福海 陜西中醫學院 (咸陽 712046)

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是由多種慢性腎臟疾病或累及腎臟的全身性疾病引起的慢性進行性腎實質損害。我們根據多年研究,提出并“排毒雙調綜合療法”治療CRF的思路,并取得較好臨床效果[1]。為進一步從實驗學角度證實該療法的作用并且從血管活性因子及鹽皮質激素角度探討其作用機制,特設計本實驗。

1 實驗材料與方法 1.1 實驗材料 1.1.1 實驗動物:SD系健康雄性大鼠,體重 200±20g,共 72只。

1.1.2 實驗用藥:①灌胃方:西洋參、制附片、白術、茯苓、黃連、蘇葉等;②灌腸方:酒大黃、制附子、煅龍骨、蒲公英等。藥物經常規煎煮、過濾、水浴蒸發分別至每毫升含生藥材 1.3g、2.6g,置 4℃冰箱備用;大鼠用量按文獻方法[2]折算。

1.1.3 主要實驗試劑:血清 BUN、Scr試劑盒,南京建成生物工程研究所出品;血漿 AngⅡ、ADL試劑盒,購自北京科美東雅生物技術有限公司。

1.2 實驗方法 1.2.1 實驗分組及造模:大鼠購回后,適應性喂養 1周,稱體重,經尿蛋白定性檢查為陰性后,隨機抽取 8只作為正常對照組(A組),其余 64只造模成功后隨機分為 5組。參照文獻方法[2],對 64只大鼠行兩期手術法造成 5/6腎切除 CRF模型,8只對照組大鼠同步進行兩期假手術。

1.2.2 喂養及給藥方式:第Ⅱ期手術后,經過 3周模型成型期,共死亡大鼠 9只。將剩余 55只模型大鼠隨機分為病理組(B組),灌胃組(C組),灌腸組(D組 ),針刺組(E組),綜合治療組即灌胃+灌腸+針刺組(F組)。各組大鼠分別給予如下處理:A、B兩組分別給予生理鹽水 2mL灌胃,1mL灌腸,四處非穴位針柄按壓。 C組予灌胃方 2mL灌胃,生理鹽水 1mL灌腸,四處非穴位針柄按壓。D組予生理鹽水 2mL灌胃,灌腸方 1mL灌腸,四處非穴位針柄按壓。E組分別給予生理鹽水 2mL灌胃,1mL灌腸 ,針刺脾俞、腎俞、足三里、三陰交。 F組予灌胃方2mL灌胃,灌腸方 1mL灌腸,針刺脾俞、腎俞、足三里、三陰交。

上述治療共持續 4周,灌胃、灌腸、針刺每日各 1次,針刺穴位按文獻方法[3]定位。

1.2.3 標本采集及觀測指標:觀察各組大鼠精神狀態、反應性、活動度、攝食情況、毛色、體重變化、二便情況及存活數等。治療結束后,停藥禁食 24h,禁水 8h,稱取大鼠體重;頸總動脈采血 2mL,用毛細吸管吸取 50μl血液測 Hb,離心后取血清檢測 BUN、Scr;頸靜脈采血 3mL,離心后取血漿測 AngⅡ、ALD含量。剝離殘腎 ,10%的甲醛溶液固定,石蠟包埋,病理切片。

1.3 統計學方法 使用 SPSS12.0for windows統計軟件,所有數據均以均數±標準差±s表示,采用單因素方差分析法對實驗結果進行統計學分析。

2 結果與分析 2.1 一般狀況 從造模到分組開始時,共死亡大鼠 9只,其中第Ⅰ期手術后死亡 4只,第Ⅱ期手術后死亡 5只。從給藥開始到實驗結束,B組死亡 3只,存活 8只;C組死亡 2只,存活 9只;D組死亡 3只,存活 8只;E組死亡 3只,存活 8只;F組死亡 2只,存活 9只。 A組全部存活,精神狀況、反應性、活動度良好,皮毛光澤、進食及二便正常,體重增加明顯;B組精神萎靡,活動遲緩,攝食減少 ,皮毛蓬松無光澤 ,明顯消瘦、體重下降 ,耳廓、尾巴蒼白,小便量少、大便稀溏;各治療組大鼠精神均較好,較活潑,攝食一般,耳廓、尾巴較紅潤,皮毛較有光澤,大便尚成形,小便量輕度增多,以 F組一般狀況的改善最佳。

2.2 治療前后大鼠體重變化 見表 1。

表1 治療前后各組大鼠體重變化比較(±s)

表1 治療前后各組大鼠體重變化比較(±s)

注:△表示與 A組比較 P＜0.01▲表示與 B組比較 P＜0.01◇表示與 C組比較 P＜0.01□表示與 D組比較 P＜0.01■表示與 E組比較 P＜0.01◆表示與 F組比較 P＜0.01。表 2相同

組 別n(只) 5周末體重(g) n(只 ) 治療后體重(g)A(空白 ) 8 258.70± 5.96 8 322.32± 9.35 B(病模 )11 215.63± 9.32△ 8 199.94± 8.45△C(灌胃 ) 11 218.54± 10.08△ 9 223.67± 9.53△▲◆D(灌腸 )11 220.61± 7.01△ 8 225.21± 9.47△▲◆E(針刺 ) 11 220.22± 6.03△ 8 214.20± 8.92△▲◆F(綜合 ) 11 215.76± 5.05△ 9 247.16± 9.91△▲◇□■

2.3 治療后各組大鼠腎功、血紅蛋白(Hb)含量 見表 2。

表2 治療結束后各組大鼠腎功、血紅蛋白值比較(±s)

表2 治療結束后各組大鼠腎功、血紅蛋白值比較(±s)

組 別 n BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) Hb(g/L)A(空白 )8 4.76± 0.89 73.50± 17.25 147.98± 8.18 B(病模 )8 14.71±1.18△ 150.11± 8.86△ 46.42± 9.94△C(灌胃 )9 9.11± 1.33△▲◆□ 129.93± 7.10△▲◆ 69.65± 10.21△▲◆D(灌腸 )8 8.00±0.77△▲◆ 131.26± 6.44△▲◆◇ 58.42± 7.76△▲◇◆E(針刺 )8 12.52±1.45△▲◆□ 140.50± 5.40△▲◆□ 55.51± 4.70△▲◇◆F(綜合 )9 6.79±0.95△▲◇ 112.85±5.48△▲ 88.44±8.11△▲

2.4 治療后各組大鼠血漿血管緊張素Ⅱ (AngⅡ )、醛固酮(ALD)含量 見表 3。

表3 治療結束后檢測各組大鼠血漿AngⅡ、ALD值比較(±s)

表3 治療結束后檢測各組大鼠血漿AngⅡ、ALD值比較(±s)

注:△表示與 A組比較 P＜0.01◇表示與 F組比較 P＜0.05▲表示與 B組比較 P＜0.01或 P＜0.05

組 別 n(只 ) AngⅡ (pg/mL) ALD(ng/mL)A(空白 ) 8 174± 24.60 0.27± 0.06 B(病模 ) 8 616± 90.80△ 0.40± 0.11△C(灌胃 ) 9 489± 58.50△▲◇ 0.33± 0.06▲D(灌腸 ) 8 514± 85.50△▲◇ 0.38± 0.09△◇E(針刺 ) 8 550± 75.70△◇ 0.38± 0.09△◇F(綜合 ) 9 401± 50.66△▲ 0.30± 0.07▲

2.5 腎臟病理學觀察 A組腎臟外觀及光鏡下腎小球、腎小管及腎間質結構正常。 B組殘腎體積明顯增大,混濁無光澤,表面凹凸不平,呈結節狀,質地堅硬。光鏡下腎小球系膜區明顯增寬,系膜細胞及系膜基質增多,毛細血管變窄,腎小囊輕度增厚,部分腎小管上皮細胞腫脹、變性,管腔變小 ,腎小管腔內可見蛋白管型,腎間質有局灶性纖維組織增生,有大量散在炎癥細胞浸潤。 C組殘腎體積增大,顏色黯淡,質地較硬,與 B組比較程度較輕。部分腎小球系膜區輕度增寬,系膜細胞及系膜基質增多,部分腎小球毛細血管變窄,可見部分腎小管腔內有蛋白管型,腎小管上皮細胞變性,部分腎間質纖維組織增生及少量散在炎癥細胞浸潤。D、E、F組外觀及光鏡下大體上同 C組。惟 F組個別腎小球系膜區輕度增寬,個別腎小球毛細血管變窄,腎小管腔內可見少量蛋白管型,部分腎間質輕度纖維化,偶見少量炎癥細胞浸潤。

3 討 論 3.1 排毒雙調綜合療法的提出 CRF是慢性腎臟疾病發展到晚期,臟腑衰敗、正氣虛竭,水飲、濕熱、瘀血等濁毒蓄積體內的疑難重癥。臨床實踐認為其病理特點是本虛標實,本虛以氣血陰陽虧損、臟腑功能虛衰為主;標實以水濕、瘀濁等毒邪為患。由于病情復雜,任何單一療法都難以奏效。針對 CRF的病機特點,以提高臨床療效為目的,我們提出“排毒雙調綜合療法”治療 CRF的思路。“排毒”指通過汗液、二便等多種途徑祛除體內蓄積之水濕、瘀濁等毒邪;“雙調”是調補氣血陰陽之虛衰,調理臟腑功能之紊亂。“排毒雙調綜合療法”,即綜合應用內服、外敷、灌腸、針灸等多種治療措施,從不同途徑排出蓄積于體內的毒邪,調補氣血陰陽,調理臟腑功能,充分發揮各種療法的優勢,最大限度地提高臨床療效。

3.2 排毒雙調綜合療法治療 CRF的療效分析 本課題以往臨床研究證實,該療法對 CRF患者具有改善臨床癥狀 ,保護殘余腎功能,延緩腎衰進展的功效[1]。實驗研究亦證實,該療法能明顯抑制 TNF-α、TGF-β在腎組織中的過度表達,能有效改善細胞凋亡的調控;調整腎組織內 SOD、MDA及 ET的活性,升高腎組織 PA蛋白的表達,降低腎組織 PAI蛋白的表達,有效維持纖溶系統平衡狀態,減輕 CRF腎組織纖維化程度 ,延緩 CRF病程進展,并較單一療法為佳[4～7]。

本實驗結果顯示,單純中藥湯劑灌胃、灌腸、針刺及綜合療法對 CRF都有一定的治療效果。在改善模型大鼠的一般狀況,阻抑體重下降,升高 Hb、糾正貧血,降低血 BUN、Scr、改善腎功,延緩 CRF大鼠腎臟病理改變等方面 ,綜合療法明顯優于單一療法。

3.3 排毒雙調綜合療法對 5/6腎切除 CRF模型大鼠血漿 AngⅡ、ALD的影響 腎小球硬化 (GS)、腎小管及間質纖維化是 CRF的主要病理變化。血漿中 AngⅡ和 ALD在該過程中具有重要意義。顧氏檢測 36例腎間質纖維化患者血漿中的AngⅡ和 ALD,顯示患者血漿中的 AngⅡ和 ALD含量均升高,且呈正相關關系[8]。AngⅡ不僅是一種血管活性因子,影響腎臟血流動力學,而且還是一種生長因子和促纖維化因子,影響腎臟固有細胞的生物學功能,促進其纖維化形成。 AngⅡ在慢性腎臟疾病的發生發展過程中起著重要作用,它直接通過影響血流動力學和間接影響細胞生長因子的作用,最終導致 GS,腎小管萎縮及腎間質纖維化直至腎功能衰竭。

ALD是體內的鹽皮質激素,主要參與電介質和水液代謝,AngⅡ與之關系密切。 AngⅡ通過促進腎上腺皮質球狀帶細胞合成和分泌 ALD,從而增加鈉、水重吸收,使血容量和血壓增高。近年研究證明 ALD還作為獨立的因素參與了腎、心、肝、肺等器官組織的纖維化。研究發現,多種腎衰竭動物模型和臨床 CRF患者均存在高醛固酮血癥[8,9]。ALD是有絲分裂和膠原合成的強烈刺激物,可以促進腎臟纖維化[10]。ALD也是慢性腎臟疾病進展中的一個獨立致病因素,它可通過血壓和直接的細胞作用造成腎損傷,ALD受體拮抗劑能夠有效的降低血壓,減少蛋白尿,延緩腎臟疾病進展,與 ACEI共同保護殘腎功能[11]。

本實驗結果顯示:模型大鼠血漿 AngⅡ和 ALD含量顯著升高,與文獻報道相吻合[8,9];經各種中醫措施治療四周后,各組大鼠血漿 AngⅡ、ALD含量均有不同程度降低,綜合療法組降低幅度最大;結合殘腎病理觀察,確實起到了延緩模型大鼠GS和腎間質纖維化的作用。綜合療法對模型大鼠起到較明顯的治療效果,發揮了保護腎功能,延緩病理進展的作用。其作用機制可能與降低血漿 AngⅡ和 ALD水平,影響腎臟血流動力學,減少水鈉潴留,拮抗腎小球硬化和腎間質纖維化而延緩腎損害的進展有關。

[1] 李小會,董正華,潘龍.排毒雙調綜合療法治療慢性腎功能衰竭 33例 [J].陜西中醫,2005,26(4):313-314.

[2] 陳孝文,梁 東,劉華鋒.慢性腎衰竭 [M].北京:中國醫藥科技出版社,2006:160-161.

[3] 李宗仁.實驗針灸學 [M].北京:中國中醫藥出版社,2003:334～ 335,327-329.

[4] 文穎娟,曾福海,董正華.排毒雙調綜合療法抗大鼠CRF腎纖維化的實驗研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2003,9(4):48-51.

[5] 許凱霞,曾福海,董正華,等.排毒雙調綜合療法對CRF大鼠腎組織 SOD、M DA影響的實驗研究 [J].山西中醫學院學報,2005,6(1):24-25.

[6] 譚穎穎,董正華,曾福海,等.灌胃灌腸加針刺法對6/5腎切除慢性腎衰竭大鼠模型血漿內皮素含量的影響 [J].陜西中醫.2005,26(11):1252-1253.

[7] 李小會,董正華,陳新政,等.排毒雙調綜合療法對大鼠 CRF細胞凋亡影響的實驗研究 [J].陜西中醫.2005,26(7):726-727.

[8] 顧 華,李艷輝 ,羅 萍,等.血漿醛固酮、血管緊張素Ⅱ含量與腎間質纖維化相關性研究 [J].中國實驗診斷學.2006,10(7):810-811.

[9] 陳 瑜.醛固酮在腎臟疾病發展和惡化中的作用[J].腎臟病與透析腎移植雜志.2004,13(4):360-363.

[10] 涂曉文.血管緊張素轉換酶抑制劑聯合血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療慢性腎臟疾病[J].國際泌尿系統雜志.2006,26(3):410-414.

[11] 何 平.醛固酮受體拮抗劑在慢性腎臟疾病中的應用 [J].國際泌尿系統雜志.2006,26(6):823-826.