中草藥飼料添加劑發(fā)酵菌種的篩選與發(fā)酵條件研究

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 蘭時樂 李立恒 胡 超 林元山 謝達(dá)平

中草藥飼料添加劑屬于天然藥物，大量研究表明，中草藥飼料添加劑具有促進(jìn)動物生長發(fā)育、提高飼料利用率、改善畜禽產(chǎn)品質(zhì)量、增強(qiáng)動物免疫功能等作用（李洪龍等，2007；劉根新等，2007；王麗輝等，2007；李宗輝等，2002；唐建安等，2000），其研究和應(yīng)用已受到國內(nèi)外研究工作者的廣泛關(guān)注。但由于中草藥飼料添加劑的應(yīng)用和研究存在用藥成分復(fù)雜、含量低、適口性差、效果不穩(wěn)定、用量大且難以掌握、毒副作用等問題，阻礙了中草藥飼料添加劑的規(guī)?；茝V應(yīng)用。微生物發(fā)酵中草藥飼料添加劑是利用微生物的降解作用，將中草藥中的有效成分、活性物質(zhì)最大限度地釋放出來，并對中草藥活性成分進(jìn)行修飾產(chǎn)生新的活性物質(zhì)。微生物在生長代謝過程中，可以產(chǎn)生各種各樣的防病助生長的次生代謝產(chǎn)物，可將動物難以消化吸收的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成易于吸收的小分子物質(zhì)，還可產(chǎn)生各種不同的酶，從而促進(jìn)動物生長發(fā)育，縮短飼養(yǎng)周期，提高飼料報酬率，增強(qiáng)藥效和降低飼養(yǎng)成本等。本文采用從不同中草藥中分離能夠發(fā)酵中草藥的微生物，對中草藥復(fù)方進(jìn)行發(fā)酵，并測定了中草藥復(fù)方發(fā)酵前后抑菌活性和纖維素酶、酸性蛋白酶活力的變化規(guī)律，以期為開發(fā)發(fā)酵型中草藥飼料添加劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥：青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草、紫草、金銀花、板藍(lán)根等中草藥，購于長沙市汽車東站中藥材市場，無霉變和蟲蛀。低溫烘干，粉碎后，過40目篩，備用。

供試菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌 （Salmonella typhimurium）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 中草藥飼料添加劑浸煮液的制備 稱取適量的中草藥飼料添加劑復(fù)方，加入20倍的蒸餾水，煎煮30 min后粗過濾，取濾液于8000 r/min離心15 min，取上清液，減壓濃縮5倍，備用。

1.2.3 霉菌分離培養(yǎng)基 馬丁氏固體培養(yǎng)基 （沈萍和陳向東，2007）中加入0.8%去氧膽酸鈉和5%中草藥飼料添加劑水煮液，pH自然。

1.2.4 液體種子培養(yǎng)基 葡萄糖5%，豆餅粉1.5%，酵母粉 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCO30.4%。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基 中草藥飼料添加劑復(fù)方90%，麥麩5%，葡萄糖 3%，（NH4）2SO41.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.2%。

1.3 方法

1.3.1 中草藥飼料添加劑發(fā)酵菌種篩選 分別稱取10 g粉碎至40目的青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草等不同中草藥于90 mL帶有玻璃珠的無菌水中，振蕩15 min后，適當(dāng)稀釋。分別取0.1 mL不同稀釋度的中草藥稀釋液于細(xì)菌和霉菌分離培養(yǎng)基平板中央，涂布均勻。細(xì)菌平板在37℃培養(yǎng)48 h，霉菌平板在28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d進(jìn)行初篩。將初篩得到的菌株采用平板劃線法分離純化后，分別接種于加有20%中草藥飼料添加劑浸煮液的細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，將復(fù)篩得到的菌株于4℃冰箱中保存待用。

1.3.2 培養(yǎng) 菌種活化：將供試菌株和Y-1接種于牛肉膏蛋白胨和PDA培養(yǎng)基斜面上，分別置于37℃和28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，備用。

液體種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)成熟的斜面菌種Y-1接種于液體種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min條件下培養(yǎng)72 h。

2）退出控制電源、儲能電源后，繼保人員手動復(fù)歸，兩信號消失。投分一次控制電源后，“告警”信號又出現(xiàn)，且無法復(fù)歸。保護(hù)裝置掉電重啟后，告警信號可手動復(fù)歸。再次分投一次控制電源，告警信號再次無法手動復(fù)歸。

中草藥飼料添加劑的發(fā)酵：按配方稱取中草藥飼料添加劑發(fā)酵培養(yǎng)基30 g于250 mL三角瓶中，自來水調(diào)節(jié)含水量50%，充分拌勻，110℃滅菌 30 min后，按10%（V/m）的接種量接種培養(yǎng)好的液體種子，28℃培養(yǎng)96 h，50℃烘干。同時以接種無菌水為對照。

1.3.3 發(fā)酵條件的研究 培養(yǎng)方法同1.3.2，替換不同的條件，如中藥與麥麩的不同比例、碳源的種類、氮源的含量、起始pH值、含水量、溫度等，考察Y-1霉菌發(fā)酵中草藥飼料添加劑后對抑菌效果的影響及Y-1霉菌的產(chǎn)酶規(guī)律。

1.3.4 抑菌試驗及酶活測定 發(fā)酵樣品處理：稱取10 g不同菌種的發(fā)酵物和各組對照物，加入200 mL蒸餾水，煮沸15 min后，3000 r/min離心15 min，收集上清液，殘渣加入200 mL蒸餾水提取后，離心，合并上清液，真空減壓濃縮至每毫升含1 g生藥。

抑菌試驗：取培養(yǎng)16～18 h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌新鮮培養(yǎng)液5 mL，分別加入100 mL冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，混合均勻后，在直徑為9 cm的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿中準(zhǔn)確吸入15 mL含菌培養(yǎng)基，冷卻成含菌平板。每個平板上放置3個滅菌的牛津杯，牛津杯中加入40 μL中草藥飼料添加劑發(fā)酵浸提液。37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈的大小。每處理設(shè)3次重復(fù)。同時以未接種的為對照。

酶活測定：（1）粗酶液制備：稱取經(jīng)低溫烘干的固體中草藥發(fā)酵劑1.00 g于100 mL pH 4.8的磷酸緩沖液中，40℃ 浸提2 h，濾紙過濾，4000 r/min離心15 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）纖維素酶活力測定：參照Vallander和Erik（1985）提供的方法并略作修改進(jìn)行測定。（3）羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測定：于25 mL具塞試管中加入濃度為 1%CMC-Na-醋酸緩沖液（pH 4.8）1.8 mL，加入0.2 mL粗酶液，50℃保溫30 min后，加入3.0 mL DNS試劑，水浴煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水定容，搖勻，于540 nm處測定光密度值。酶活定義：在反應(yīng)條件下，30 min水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U）；（4）FPA活力測定： 于 25 mL具塞試管中加入pH 4.8的醋酸緩沖液1.8 mL、新華濾紙50.0 mg以及酶液0.2 mL，50℃保溫60 min后，加入3.0 mL DNS試劑，其他同CMCase酶活測定。酶活定義：在反應(yīng)條件下，每60 min水解濾紙產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U）。（5）酸性蛋白酶活力測定：參照姜錫（1999）提供的方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥飼料添加劑發(fā)酵菌種的篩選 從青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、貫眾、膽草、石菖蒲、夏枯草等中草藥中共分離出22株微生物菌株，其中細(xì)菌14株，霉菌8株。將純化的菌株點種在含藥濃度逐步遞增的固體培養(yǎng)基平板上，通過多次反復(fù)篩選，得到一株在中藥復(fù)方中生長良好、發(fā)酵能力較強(qiáng)的菌株，初步鑒定為米曲霉Y-1。

2.2 中草藥飼料添加劑與麥麩比例對Y-1霉菌產(chǎn)酶的影響及抑菌效果的影響 分別配制中藥與麥麩不同比例（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4）的發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%（V/W）接種量接種Y-1種子培養(yǎng)液，28℃恒溫培養(yǎng)72 h，測定酶活，同時提取發(fā)酵液進(jìn)行抑菌實驗，結(jié)果見表1、圖1。

從表1可以看出，中草藥飼料添加劑中添不同比例的麥麩發(fā)酵后對四種供試菌的抑菌效果都有不同程度的增加。當(dāng)中草藥飼料添加劑與麥麩的比例為7∶3時，發(fā)酵物料的蒸煮液對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌效果分別增加38.61%、22.32%、27.93%和11.4%。從產(chǎn)酶效果來看（如圖1），在一定范圍內(nèi)，隨著麥麩比例的增加，纖維素酶的活力增強(qiáng)，當(dāng)中草藥飼料添加劑與麥麩的比例為7∶3時，CMCase酶活達(dá)9870 U/g，F(xiàn)PA酶活為892 U/g，主要原因為中草藥中含有大量的纖維素，能夠誘導(dǎo)真菌纖維素酶的分泌，高纖維素酶活力可以破壞中草藥的細(xì)胞壁，導(dǎo)致中草藥有效成分的充分釋放，從而提高了中草藥發(fā)酵后的抑菌效果。而蛋白酶的酶活隨著麥麩含量的增加而增加，主要原因為麥麩中含有一定量的蛋白質(zhì)，可以誘導(dǎo)蛋白酶的合成和分泌。綜合抑菌效果和各種酶的含量，以下試驗均選擇中草藥飼料添加劑和麥麩的比例為7∶3。

表1 中草藥飼料添加劑與麥麩比例對抑菌效果的影響

圖1 中草藥飼料添加劑與麥麩比例對酶活的影響

2.3 不同碳源對Y-1霉菌產(chǎn)酶的影響及抑菌效果 在其他條件相同的情況下，向培養(yǎng)基中分別加入1%的蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖，以不加其他碳源為對照，28℃恒溫培養(yǎng)120 h，測定纖維素酶和蛋白酶的酶活，并測定抑菌活力。結(jié)果分別見表2和圖2。

從表2中可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的不同碳源，可以明顯提高發(fā)酵中草藥飼料添加劑的抑菌效果。在添加的四種碳源中，以添加葡萄糖的處理，發(fā)酵物料蒸煮液的抑菌效果最好，其次是蔗糖。與對照相比，添加葡萄糖對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris 的抑菌效果分別提高了18.6%、24.79%、31.48%、17.6%。從圖2中可以看出，葡萄糖為碳源時，發(fā)酵后物料的CMCase酶、FPA酶和蛋白酶的活力最高，分別達(dá)到9017、1062 U/g和7793 U/g，蔗糖次之。說明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量葡萄糖，可以促進(jìn)霉菌Y-1的生長和酶的分泌。

2.4 培養(yǎng)溫度對抑菌效果和酶活力的影響 將中草藥飼料添加劑培養(yǎng)物分別置于不同的溫度（28、30、32、35 ℃和 37 ℃） 下恒溫培養(yǎng) 120 h，測定酶活和抑菌活性。結(jié)果分別見表3和圖3。

表2 不同碳源對抑菌效果的影響

圖2 不同碳源對酶活的影響

從表3可知，培養(yǎng)溫度在28～32℃時，隨著溫度的升高，發(fā)酵物料的抑菌作用也隨之提高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為32℃時，發(fā)酵物料對S.aureus、S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌活性較 28 ℃發(fā)酵時分別提高 19.08%、16.94%、9.42%和12.6%。但培養(yǎng)溫度超過32℃，抑菌作用隨著培養(yǎng)溫度的升高而下降。不同培養(yǎng)溫度對纖維素酶和蛋白酶的酶活影響也很大，CMCase酶活和蛋白酶酶活在32℃時最高，隨著培養(yǎng)溫度升高，酶活降低較為明顯；FPA酶活在28～35℃變化不是很明顯，但培養(yǎng)溫度超過37℃，酶活同樣降低（見圖3）。因此確定培養(yǎng)溫度為32℃。2.5 起始pH對抑菌效果和酶活的影響 在上述的基礎(chǔ)上，選擇不同的起始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）進(jìn)行發(fā)酵，考察不同起始 pH 條件下抑菌效果及酶活變化規(guī)律。結(jié)果見表4和圖4。

表3 不同培養(yǎng)溫度對抑菌效果的影響

圖3 培養(yǎng)溫度對酶活的影響

表4和圖4表明，發(fā)酵物料的初始pH值在6.0～7.0，對供試菌的抑菌效果變化不顯著；而纖維素酶和蛋白酶酶活在pH 6.0～6.5保持較高的酶活力。因此，在發(fā)酵前可不需調(diào)節(jié)發(fā)酵物料的pH值，采用自然pH值即可。2.6 物料含水量對抑菌效果和酶活的影響 分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為30%、40%、50%、60%、70%，其他條件不變，考察不同含水量發(fā)酵條件下的抑菌效果和酶活變化。結(jié)果見表5和圖5。

表4 起始pH值對抑菌效果的影響

圖4 起始pH值對酶活的影響

水是任何生物在生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。固體基質(zhì)中水分含量太少，會影響微生物對物質(zhì)的分解利用和微生物的代謝活動；水分含量太高，會影響原料顆粒之間的松散性，使原料顆粒成團(tuán)，影響氧的傳遞和發(fā)酵熱的散失，并容易造成厭氧環(huán)境。從表5可以看出，當(dāng)發(fā)酵物料的含水量為50%時，對四種供試菌的抑菌活性最高；從產(chǎn)酶的變化規(guī)律分析，CMCase酶和蛋白酶酶活力在含水量為60%時，酶活最高，分別達(dá)到8107 U/g和3158 U/g，而FPA酶活在含水量為50%時最高，達(dá)到1857 U/g（見圖5）。為生產(chǎn)實際考慮，發(fā)酵物料的含水量控制在50%～60%為宜。

表5 含水量對抑菌效果的影響

圖5 含水量對酶活的影響

2.7 發(fā)酵時間對抑菌效果及酶活的影響 將中草藥飼料添加劑發(fā)酵培養(yǎng)基分別培養(yǎng)不同時間（24、48、72、96、120 h），其他條件不變，取樣低溫干燥后測定抑菌效果和酶活。結(jié)果見表6、圖6。

從試驗結(jié)果可以看出，發(fā)酵時間對酶的產(chǎn)量和抑菌效果影響較大。發(fā)酵前期，主要是微生物生長階段，隨著培養(yǎng)時間的延長，微生物酶特別是纖維素酶合成量加大，中草藥細(xì)胞壁破壞程度加劇，使中草藥中有效成分逐步釋放出來，到發(fā)酵72 h，中草藥飼料添加劑發(fā)酵物料對四種供試菌的抑制效果較發(fā)酵前分別增加60.83%、41.32%、36.03%和27.64%，但發(fā)酵時間超過72 h，抑菌活性下降，原因可能為部分中草藥有效成分被微生物酶修飾或被微生物轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物。從發(fā)酵時間對產(chǎn)酶規(guī)律的影響分析，發(fā)酵第96 h產(chǎn)酶達(dá)到高峰，CMCase、FPA酶和蛋白酶酶活分別達(dá)到9653、971 U/g和6357 U/g。綜合發(fā)酵物料的抑菌活性，確定發(fā)酵時間為72 h。

3 結(jié)論

3.1 通過在分離培養(yǎng)基中加入中草藥提取液，從中草藥青蒿、魚腥草、地骨皮、黃岑、膽草、夏枯草等中草藥中篩選到1株能發(fā)酵中草藥飼料添加劑的菌株，初步鑒定為米曲霉Y-1。

表6 發(fā)酵時間對抑菌效果的影響

圖6 發(fā)酵時間對酶活的影響

3.2 通過對中草藥飼料添加劑發(fā)酵條件的研究，確定了中草藥飼料添加劑合適的發(fā)酵條件為：中草藥飼料添加劑與麥麩的比例為7∶3、葡萄糖1%、發(fā)酵溫度32℃、初始pH自然、物料含水量50% ～60%、發(fā)酵周期為72 h。在此條件下，發(fā)酵料蒸煮液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性分別較對照提高 36.03%、60.83%、27.64%、41.32% ，CMCase、FPA酶和蛋白酶酶活分別達(dá)到9653、971 U/g和 6357 U/g。

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