溶菌酶對肉雞食糜微生物數量、免疫及生產性能的影響

武漢新華揚生物股份有限公司 程時軍

華中農業大學動物科技學院 馬立保＊

鑒于抗生素的使用會帶來畜禽產品藥物殘留、耐藥基因轉移到微生物等負面作用，近年來許多國家開始逐步限制使用飼用抗生素，因此新的、安全高效的飼用抗生素替代品的開發已是迫在眉睫，早已應用于食品及醫療行業中的溶菌酶因是蛋白質類，具有類似抗生素的作用特點，近年來受到了畜牧行業的普遍關注。本試驗以溶菌酶取代飼料中的抗生素添加劑，結合相關抗生素的研究方向，探討溶菌酶對肉雞生產性能的影響并簡要探討其機制，為溶菌酶在飼料工業中取代抗生素的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及動物 溶菌酶：500000 U/g，由武漢新華揚生物股份有限公司提供，酶活單位定義：在25℃、pH為6.2的條件下，于450 nm處每分鐘引起溶酶小球菌體溶液吸光度下降0.001為1個酶活力單位（U）。

1.2 試驗日糧 參照《中華人民共和國農業行業標準NY/T 33-2004》配制玉米-豆粕型粉料，基礎日糧組成及營養水平見表1。

1.3 試驗分組 采用單因子試驗設計，選擇144只1日齡艾維茵肉雞仔隨機分4為組，每組6重復，每重復6只，公母各半，各處理見表2。

1.4 飼養管理 試驗肉雞地面平養，自由采食和飲水，試驗分0～3周齡和4～6周齡兩個階段；室內溫度按艾維茵飼養標準控制；在3周齡時以地克珠利飲水防球蟲病；免疫程序：7 d新城疫Lasota+傳染性支氣管炎H120二聯苗滴鼻、點眼，14 d和21 d IBD飲水。

表1 試驗基礎日糧組成及營養水平

表2 試驗分組及日糧處理

1.5 測定指標 21日齡和42日齡清晨以重復為單位稱雞活重和余料重量，計算不同階段肉雞平均日采食量、平均日增重及料重比。于42日齡清晨從各處理雞中隨機選取6只 （每重復1只），編號稱重后，翅靜脈采血備用測血清新城疫抗體效價；采血后進行屠宰，迅速取脾臟保存測細胞因子；取十二指腸、空腸各2 cm左右，并以棉線結扎兩端，用酒精棉球消毒各結扎口，置于冰盒送實驗室超凈臺食糜微生物待測，最后取其胸腺、法氏囊稱重。

1.6 檢測方法

1.6.1 血清新城疫抗體效價 采用血凝抑制法（HI）測定（楊漢春，2003）。

1.6.2 食糜微生物數量 超凈工作臺中，從腸道分別取0.5 g食糜，加入4.5 mL PBS稀釋液，靜置5 min后，取上清液0.5 mL于4.5 mL稀釋液，依次倍比稀釋到 10-9后，分別從 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9濃度離心管中取 100 μL 于大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌及梭菌選擇性培養基培養。以每平皿菌落數30～200個為有效，每樣作2平行，取平均數。菌落數計數公式：每g內容物菌落數=lg[（菌落數×稀釋倍數×每次稀釋取樣毫升數）/（接種用樣品毫升數×樣品克數）]

1.6.3 細胞因子TNF-α，IL-1 mRNA 用TRIzol提取脾臟RNA進行反轉錄，通過RT-PCR檢測細胞因子TNF-α，IL-1 mRNA設計引物擴增相應基因片段 （見表3）。RT-PCR反應程序：95℃、2 min，1 個循環，然后 95 ℃、15 s，56 ℃、30 s，68 ℃、45 s，共35個循環。

表3 實時定量PCR所用引物

1.7 數據分析 數據用平均數±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件進行ONE-WAY ANOVA分析，并以LSD作多重比較。試驗數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 溶菌酶對42 d肉雞十二指腸食糜微生物數量的影響 見表4。從表4可以看出，3個試驗組十二指腸中梭菌總數分別比對照組極顯著降低了4.03%、2.6%和5.6%（P＜0.01）；與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組2極顯著降低了大腸桿菌總數（P＜0.01）；各處理對十二指腸雙歧桿菌和乳酸桿菌有降低的趨勢，但無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 溶菌酶對42 d肉雞空腸食糜微生物數量的影響 見表5。從表5可見，與對照組相比，抗生素組極顯著降低了空腸梭菌總數（P＜0.01），2個溶菌酶處理組顯著降低空腸梭菌總數 （P＜0.05）；與對照組相比，溶菌酶組1顯著降低了空腸大腸桿菌總數（P＜0.05）；各處理對空腸雙歧桿菌和乳酸桿菌有降低的趨勢，但無顯著差異（P＞ 0.05）。

表5 溶菌酶對42d肉雞空腸食糜微生物數量的影響

2.3 溶菌酶對肉雞免疫器官指數的影響 見表6。從表6可見，與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組2可顯著降低肉雞胸腺指數分別達31.3%和26.9%（P＜0.05），溶菌酶組1胸腺指數降低16.8%（P＞0.05）；與對照組相比，溶菌酶組2可顯著降低法氏囊指數23.3%（P＜0.05），抗生素與溶菌酶組1也可降低法氏囊指數，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。

2.4 溶菌酶對42 d肉雞血清新城疫抗體效價的影響 見表6。從表6可以看出，與對照組相比，溶菌酶組1極顯著降低了肉雞血清新城疫抗體水平21.1%（P＜0.01），抗生素組及溶菌酶組2也顯著降低了 15.8%和 15.8%（P＜0.05），3個試驗組間抗體水平差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 溶菌酶對肉雞細胞免疫因子的影響 見表7。從表7可以看出，與對照組相比抗生素組及溶菌酶組2脾臟IL-1β mRNA表達豐度極顯著降低19.3%和24.6%（P＜0.01），溶菌酶組2相對溶菌酶組1 IL-1β mRNA表達豐度降低了18.9%（P＜0.05）；與對照組相比，不同試驗處理組脾臟TNF-α mRNA表達豐度均有所降低但差異不顯著（P ＞ 0.05）。

表6 溶菌酶對42 d肉雞免疫器官指數和ND抗體水平的影響

表7 溶菌酶對42 d肉雞脾臟細胞因子TNF-α，IL-1β mRNA 表達豐度的影響

2.6 溶菌酶對肉雞生產性能的影響 見表8。從表8可以看出，試驗前期肉雞的平均日采食量各組之間差異顯著（P＞0.05）；試驗各處理組料重比均有降低的趨勢，與對照組相比，抗生素組降低了9.8%，兩個溶菌酶組分別降低了7.0%和8.0%。與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組2顯著提高了前期肉雞的平均日增重（P＜0.05），分別提高了11.1%和7.3%。各處理對后期肉雞的平均日采食量無顯著影響（P＞0.05）；與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組2顯著提高了后期肉雞的平均日增重 （P＜0.05），提高幅度分別達到12.4%和12.2%；與對照組相比，抗生素組和溶菌酶組1分別降低了料重比10.2%和9.0%，但差異不顯著（P＞0.05），溶菌酶組2肉雞后期料重比則顯著降低了 11.0%（P ＜0.05）。

從全期數據來看，與對照組相比，3個處理組對肉雞平均日采食量無顯著影響（P＞0.05）；各處理組均極顯著提高了肉雞平均日增重和料重比（P＜0.01）。使用溶菌酶與抗生素在平均日采食量、日增重及料重比方面未表現出顯著差異（P＞0.05），溶菌酶組2相對溶菌酶組1料重比降低了2.58%（P ＞ 0.05）。

表8 溶菌酶對不同階段肉雞生產性能的影響

3 討論

3.1 溶菌酶對肉雞食糜微生物數量的影響 腸道菌群最終反映其與宿主的共生關系，微生物的變化會影響動物的健康、生長及成熟（Hill，1982）。本試驗結果發現，溶菌酶同抗生素一樣影響了肉雞的腸道微生物數量，且對革蘭氏陽性菌如梭菌更為敏感，主要原因是革蘭氏陽性菌細胞壁組成主要是肽聚糖，會被溶菌酶中N-乙酰胞壁質聚糖水解酶直接水解而導致死亡，這與楊露青等（2003）研究報道的結論較類似。本試驗還發現，溶菌酶對雙歧桿菌和乳酸桿菌無顯著影響 （P＞0.05），可能原因是雙歧桿菌和乳酸桿菌這2種微生物因梭菌數量減少而具備了增殖優勢，另外跟這種細菌的細胞壁結構特點有關。

3.2 溶菌酶對肉雞免疫機能的影響

3.2.1 溶菌酶對肉雞免疫器官和體液免疫的影響機體免疫器官指數如法氏囊指數反映了動物的免疫器官發育狀況和免疫功能。本試驗發現，溶菌酶和抗生素在一定程度上降低肉雞免疫器官指數和ND抗體水平，有降低動物免疫活化狀況的趨勢，與佟建明等（2001）研究結果類似。

3.2.2 溶菌酶對肉雞細胞因子的影響 抗生素通過抑制或殺滅病原微生物，減少機體的免疫應答，從而降低細胞因子如IL-1的水平，降低動物的免疫應激（Roura等，1991），進而改變飼料效率。微生物會影響細胞因子含量（Hill等，1952）。動物生長性能的下降是感染的反應（Murray，1979），并且它至少一部分是受IL-1調節 （Mccarthy等，1985）。這種下降也是由于基礎代謝率的提高、營養物質吸收的變化及組織成分改變所致（Klasing和Peng，1987）。本試驗發現，抗生素組及溶菌酶組2脾臟IL-1β mRNA水平極顯著降低 （P＜0.01），不同試驗處理脾臟TNF-α mRNA水平也均有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），表明溶菌酶與抗生素有類似作用：通過減少微生物特別有害微生物的數量，降低微生物對動物免疫系統的刺激，從而一定程度上抑制了致炎細胞因子產生，這與 Naqi（1984）、Roura（1991）報道類似。 導致此現象的另一可能原因是溶菌酶通過靜電作用結合脂質A和脂多糖，導致酰基鏈固化和內毒素分子從立方體形向多層結構轉變，從而阻止內毒素與巨噬細胞受體互作，減少促炎癥反應細胞因子如IL-1、IL-6 及 TNF-α 的釋放 （Klaus等，1998；Takada 等，1994）。

3.3 溶菌酶對肉雞生產性能的影響 關于溶菌酶與抗生素在畜禽中應用的效果比較已有報道。孫小青（2008）研究表明,溶菌酶取代抗生素可顯著提高肉鴨增重2.33%（P＜0.05）和降低增重成本（P＜0.05），對料重比也有改善，綜合其他指標溶菌酶在肉鴨中應用總體效果好于抗生素。張世卿等（2008）也發現，添加溶菌酶可降低肉仔雞采食量、料重比，提高日增重，且一定添加量可顯著改善肉雞全期（0～6周齡）日增重和料重比（P＜0.05）。Brooke等（2002）使用老鼠表達的溶菌酶飼喂肉雞也有較好的促生長效果。本試驗發現，不同處理對肉雞不同階段日采食量并無顯著影響（P＞0.05），原因可能是肉雞采食量更多受日糧能量水平等因素的影響；300 g/t溶菌酶對肉雞平均日增重和料重比均有顯著改善（P＜0.05），與抗生素的效果無差別（P＞0.05），可能原因是溶菌酶減少了有害微生物對肉雞腸道的刺激，雞的免疫器官發育變慢，炎性因子降低，攝入的營養用于維持減少，從而用于生產的數量相應增加，所以在采食量不變的情況下，肉雞增重增加。

4 結論

4.1 飼料中添加溶菌酶可降低食糜中有害微生物（梭菌和大腸菌類）數量（P＜0.05）；一定程度上降低了肉雞免疫器官指數、新城疫抗體水平、IL-1β mRNA和TNF-α mRNA的表達豐度。

4.2 溶菌酶對肉雞平均日采食量無顯著影響（P＞0.05），極顯著提高了整個試驗期肉雞平均日增重，降低了料重比（P＜0.01），每噸飼料添加150 g溶菌酶可替代抗生素不影響肉雞生產性能。

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