淺談“基因敲除”

摘要 鑒于近年來基因敲除頻繁地出現在高中生物教材和試題中，又基于基因敲除與基因工程的聯系以及基因敲除的廣泛的應用價值，對基因敲除作了簡單的探討。

關鍵詞 基因敲除 基因工程 轉基因技術

中圖分類號 Q-49

文獻標識碼 E

科學界曾預言，21世紀是一個基因工程世紀。所謂基因工程(轉基因技術)，又稱基因拼接技術或DNA重組技術，誕生于20世紀70年代，是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達。“基因敲除”是在20世紀80年代悄然誕生并發展起來的一項重要的分子生物學技術，字面上看與轉基因相反，認為轉基因技術是導入某個基因，而基因敲除是切除某個基因，實質上并不是如此簡單，很大程度上，基因敲除和轉基因技術有相似性，轉基因技術的原理是基因重組，而基因敲除主要也是應用DNA同源重組原理。

1 “基因敲除”在高中生物教材中的出現

浙科版教材，選修三《現代生物科技專題》一書的第52頁中第二段第二行，出現了“基因敲除”四個字，書本原話：“胚胎干細胞可以進行基因敲除，獲得基因敲除動物，如用基因敲除手段可以獲得適合人體移植的豬器官，減弱或消除排斥反應。”

2 基因敲除的概述及方法

2.1基因敲除概述

基因敲除自20世紀80年代末發展起來，是建立在基因同源重組技術基礎以及胚胎干細胞技術基礎上的一種定點修飾基因組的新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術，其與體細胞核移植技術的成功結合，已經成為一種有效的定點修飾、改造大動物基因組DNA片段的實驗策略。或者說基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾、改造染色體上某一基因的目的的一種技術。它克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。20世紀80年代初，胚胎干細胞(ES細胞)分離和體外培養試驗的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。1987年，Thompson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術得到了進一步的發展和完善。

簡單的說基因敲除是指將目標基因從基因組中刪除。舉一個簡單的例子：比如有一段“序列”：“1234567890”(原基因)，敲除后為“1237890”，一般一個敲除載體還會在其中插入一段外源基因，如“ABC”，則新的基因為“123ABC7890”，或者不插入基因直接連接，則為“1237890”。

通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組外，新的原理和技術也逐漸被應用，比較成功的有基因的插入突變和RNAi，它們同樣可以達到基因敲除的目的。在基因敲除技術中涉及到的變異類型有：基因重組、基因突變、人工誘變。

2.2實現基因敲除的多種原理和方法

利用基因同源重組進行基因敲除。此方法依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。第一步是構建基因載體；第二步是獲得Es細胞(同源的胚胎干細胞)；第三步是同源重組，將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導入Es細胞中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內源基因組中。從而得以表達。一般地，顯微注射命中率較高，但技術難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。

利用隨機插入突變進行基因敲除。此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞。

RNAi引起的基因敲除。由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中，所以RNAi的反應過程也可以用于基因敲除。近年來，越來越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡便的方法。

3 基因敲除技術的應用及前景

3.1建立生物模型

模型生物的建立在基因功能、代謝途徑等研究中非常重要。基因敲除技術就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進行相關的研究。這些模型可以是細胞，也可以是完整的動植物或微生物個體，最常見的是小鼠、家兔、豬、線蟲、酵母和擬南芥等。

3.2疾病的分子機理研究和疾病的基因治療

通過基因敲除技術可以確定特定基因的性質以及研究它對機體的影響。這無論是對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標都有重大的意義。目前基因敲除技術在Ⅱ型糖尿病研究和在腎素一血管緊張素系統研究中有了普遍和深入的應用。

3.3提供廉價的異種移植器官

眾所周知，器官來源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素，而大量廉價的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因為異源生物的基因會產生一些能引起人體強烈免疫排斥的異源分子，如果能將產生這些異源分子的基因敲除，那么動物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來巨大的福音。如：PPL Therapeutics公司于1999年成功地在豬的體細胞中用基因敲除技術敲除了α-1，3GT基因。使每只豬都缺乏產生α1－3半乳糖基轉移酶基因的2個拷貝。這些酶在細胞表面產生一種糖分子，人體的免疫系統可以立即辨認出這種糖分子為異源性，從而引發超急性免疫排斥反應。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應則不會再發生。

3.4免疫學中的應用

同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時或多或少會有一定的免疫排斥，使得人用抗體類藥物的生產和應用受阻。而如果將動物免疫分子基因敲除，換以人的相應基因，那么將產生人的抗體，從而解決人用異源抗體的生產問題。

3.5改造生物、培育新的生物品種

細菌的基因工程技術是本世紀分子生物學史上的一個重大突破，而基因敲除技術則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術支持。

3.6微生物代謝工程方面的應用

利用基因敲除技術可阻斷細胞的代謝旁路，或通過引入突變位點改變目的產物的產量或質量而達到調節代謝流，優化代謝途徑的目的。

4 基因敲除技術的缺陷

隨著基因敲除技術的發展，早期技術中的許多不足和缺陷都已經解決，但基因敲除技術始終存在著一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能；另一方面，對于某些必需基因，敲除后會造成細胞的死亡，也就無法對這些必需基因進行相應的研究。

基因敲除技術的誕生可以說是分子生物學技術上繼轉基因技術后的又一革命。尤其是條件性、誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確，效果更加精確、可靠，它的發展將為發育生物學、分子遺傳學、免疫學及醫學等學科提供一個全新的、強有力的研究和治療手段，具有廣泛的應用前景和商業價值。