航天搭載紫花苜蓿連續(xù)后代變異株系選育

范潤鈞，鄧 波，陳本建，柴小琴，張?zhí)N薇

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京100193；

3.甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學研究所，甘肅天水741000）

航天育種（或太空育種）又稱空間誘變育種，其具有變異頻率高、變異幅度大、有益變異多、穩(wěn)定性強，優(yōu)勢明顯。它是指利用返回式衛(wèi)星或高空氣球將植物種子帶到太空，利用太空特殊的環(huán)境（空間宇宙射線、微重力、高真空、弱磁場等因素）使種子產(chǎn)生變化，引起生物體染色體畸變，進而導致生物體遺傳變異，經(jīng)地面種植選育新種質、新材料，培育新品種的植物育種新技術[1]。航天育種研究開始于1987年，到目前為止，我國利用返回式衛(wèi)星先后進行了13次70多種農(nóng)作物的空間搭載試驗，共搭載糧食、經(jīng)濟作物、蔬菜、花卉、微生物菌株等800多個品種，經(jīng)全國23個省市109個科研及生產(chǎn)單位的農(nóng)業(yè)專家和技術人員的試驗選育，取得可喜的成果[2]。空間誘變作為一種新的物理誘變手段，已被廣泛應用于多種生物材料誘導變異，從中選育出一批新的優(yōu)良品種，顯示了空間環(huán)境中致突變因素的存在及其有效性[3]。

本研究是在篩選出航天搭載紫花苜蓿第1代突變單株的基礎上，為后續(xù)世代的高品質選育工作進行展望，并提出建議和方法。

1 空間搭載紫花苜蓿種子第1代植株表型變異及基因多態(tài)性分析

1.1 供試材料

為4個紫花苜蓿品種，搭載于“神州三號”衛(wèi)星，飛行時間從2002年3月25日至4月1日，共7 d，飛行高度為198～338 km，傾角42.4°，繞地球108圈[4]。4個紫花苜蓿品種分別為：A.得福（52株）；B.德寶（47株）；C.阿爾剛金（66株）；D.三得利（59株），均為SP1植株。于2009年4月22日取自甘肅天水西部航天育種中心。

1.2 主要技術路線

田間性狀調查選材→DNA的提取→SSR引物的篩選→SSR-PCR擴增→瓊脂糖凝膠電泳→聚丙烯酰胺凝膠電泳→電泳譜帶的統(tǒng)計分析→數(shù)據(jù)處理→確定變異單株。

1.3 試驗結果

經(jīng)搭載后的種子萌發(fā)獲得的第1代（SP1，表示經(jīng)飛船搭載后回收種植的第1代，后面各世代依次類推）植株中，大部分生長正常，無嚴重生理損傷，且結實率接近地面對照。但也有一些植株高度、葉片大小及葉色等發(fā)生了變化。根據(jù)4個主要變異性狀植株較高、葉色較深、葉片較大、多葉，分別篩選出4個紫花苜蓿品種的變異單株。

采用正交設計優(yōu)化紫花苜蓿SSR-PCR反應體系，25μL反應體系包括 Mg2+2.5 mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物 0.7μmol/L，Taq DNA聚合酶2 U以及2.5μL 10×buffer和60 ng模板DNA。循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性3min；95℃變性1min，52 ℃退火 1.5min，72 ℃延伸 60 s，共循環(huán)35次；最后72℃保溫8min；4℃保存。利用該反應體系從17對SSR引物中，篩選出6對擴增產(chǎn)物具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物。

利用優(yōu)化的SSR-PCR反應體系及篩選出的多態(tài)性較好的引物，對材料進行檢測，共檢測到25個等位基因，每對引物檢測出2～8個等位基因，平均為4.17個。結合4個突變指標，檢測經(jīng)過篩選的植株的等位基因頻率及每個位點的多態(tài)性信息量（PIC），PIC變化于0.221 6～0.832 8之間，平均為0.636 6，并對多態(tài)基因植株與篩選出的表型變異植株的多態(tài)性作相關性分析，根據(jù)檢測結果初步確定13株突變植株（表1）。

由表1可 知，A-07，B-35，C-01，C-28 和D-21這5個SP1植株，可在其基因組檢測到7個以上的多態(tài)性等位基因。結合表型變化分析發(fā)現(xiàn)，基因組多態(tài)率高的植株大多數(shù)都有較明顯的變異表型（如 C-01，C-28，D-49等）；但也有個別基因組多態(tài)率高的植株（如A-07），在本研究觀察的數(shù)個表型范圍內未發(fā)現(xiàn)形態(tài)性狀的變異。可見，SP1植株的基因組DNA多態(tài)性與所觀察的表型變異之間有一定的相關性，但不是必然聯(lián)系。

表1 基因組多態(tài)率較高的SP1植株及其表型變異

2 篩選株系后代植株表型及基因組變異展望

2.1 后續(xù)世代的種植和篩選方法

林作楫等[5]在1996年選用不同小麥品種（品系）進行衛(wèi)星搭載，搭載種子在田間種植后，對SP2進行分析，可看到部分搭載材料在一些重要農(nóng)藝性狀上有明顯變異，從中選出一批優(yōu)良品系，產(chǎn)量較原始品種（品系）有顯著提高，預期將有2～3個材料在生產(chǎn)上推廣。本試驗通過表型觀察以及分子標記手段，從SP1植株中共篩選出13個株系，每個單株收種30粒，種植成SP2株系，再用同樣的種植篩選方法，經(jīng)3～4代（SP3～SP4）選育獲得形態(tài)性狀明顯變異并能穩(wěn)定遺傳的突變株，種成SP5的突變株系。另外，還混收與地面對照組形態(tài)性狀沒有明顯差異的第1代單株種子，混播種植SP2，繼續(xù)選擇與地面對照組形態(tài)性狀有明顯差異的單株，對形態(tài)性狀變異的單株進行多代種植和選育，獲得形態(tài)性狀明顯變異并能穩(wěn)定遺傳的突變株系。具體種植及篩選流程如圖1所示。

2.2 篩選株系后代植株表型及基因組變異探討

與地面對照組相比，篩選出的13株SP1植株，大多數(shù)都存在表型變異特征。一般變異植株在其后的連續(xù)3代的分離有以下3種類型[6-8]：（1）前代的某些形態(tài)性狀變化在后代某些單株得以保留，甚至更明顯；（2）前代單株的形態(tài)性狀變化在后代中逐漸回復；（3）后代單株出現(xiàn)前代所沒有的新的形態(tài)性狀變化。

為探索經(jīng)飛船搭載后種子的基因組變異在世代遺傳中的規(guī)律性，進一步應用分子標記技術跟蹤分析以上13個篩選出的變異單株及其連續(xù)多代單株基因組變化。

經(jīng)過4代種植和跟蹤分析后，探求穩(wěn)定突變株系基因組多態(tài)性等位基因的來源以及能否穩(wěn)定地遺傳給后代，以選育出高品質紫花苜蓿。然后對穩(wěn)定突變株的連續(xù)多代（即從第一代開始到穩(wěn)定突變體的連續(xù)多代）作分子標記檢測，進而找到穩(wěn)定遺傳的突變單株。

3 穩(wěn)定突變體生理生化指標檢測

對穩(wěn)定遺傳的突變單株進行生理生化指標檢測，進一步證明突變株系的優(yōu)良變異。經(jīng)過圖1的篩選模式，對每一代材料都綜合田間性狀觀察、考種分析數(shù)據(jù)，選出性狀變異較明顯的單株。對穩(wěn)定突變株系的變異性狀進行多代跟蹤，并用Excel軟件的單因素顯著性分析方法，對突變株系與地面對照組的各性狀進行顯著性比較分析。同時，檢測變異單株各項生理生化指標[9]。（1）與抗旱性相關的生理指標：葉片相對含水量、細胞膜透性、葉綠素含量、POD活性、葉片超微結構。（2）與抗寒性相關的生理指標：SOD活性、POD活性、CAT活性、游離脯氨酸含量、葉綠素含量、抗壞血酸含量。（3）與耐鹽堿生理相關的指標：細胞膜透性、丙二醛和游離脯氨酸含量、株高、鮮質量、干質量。

4 世代遺傳討論

由于太空空間存在各種無法控制的誘變因素，因此，空間誘變處理對作物的誘變方向也具有不確定性。一方面空間誘變可以創(chuàng)造出符合人類需要的各種變異類型，經(jīng)過選擇可以創(chuàng)造有益的新種質，培育新品種。另一方面，空間誘變群體中并不是所有的變異都是有利的，而且空間誘變也不是對所有性狀都能產(chǎn)生顯著的作用[10]。

一般認為，飛船搭載使被搭載的種子基因組產(chǎn)生損傷，第一代植株基因組中的變異可以遺傳給后代單株，使后代單株基因組與前代具有相同的多態(tài)性；遺傳物質DNA分子的輻射損傷也可能部分被修復，后代單株基因組多態(tài)率下降；而DNA分子的輻射損傷不完全修復或錯誤修復，也可使后代單株基因組出現(xiàn)新的多態(tài)性等位基因，多態(tài)率增加。經(jīng)過4或5代的種植，未修復的損傷及其導致的基因組變異能穩(wěn)定地遺傳給后代，獲得表型和基因型變異均穩(wěn)定的突變株系[4]。

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